图1。KAPA通用适配器与所有384 KAPA UDI底漆混合在KAPA HyperCap Workflow v3中表现一致。在一次运行中对包含所有384个UDI对的重复库进行排序后，在所有UDI对中证明了高再现性。过滤后的读取具有高特异性(目标读取百分比)，深度目标覆盖率(> 50X覆盖的%碱基)和高一致性(0.5X - 2倍中等覆盖范围内的%碱基)。总重复率为3.2% + 0.2%，fold-80基础惩罚为1.32 + 0.01。实验设计:使用KAPA HyperCap遗传面板(10 Mb捕获目标)和KAPA HyperPlus Kit，使用KAPA HyperCap Workflow v3准备重复库;输入= 100 ng人类基因组DNA (NA12878;柯瑞尔研究所)。库在捕获之前被复用，总共12 x 32-plex捕获(总共384个丰富的库)。所有富集的文库然后在NovaSeq™6000系统通道上以2 x 100 bp进行汇总和测序，经过质量过滤后，每个样品的平均reads约为5680万。在每个样品降采样2000万次读取后，分析遵循技术说明“如何评估KAPA目标浓缩数据”(2020年3月)1。总重复率为3.2% + 0.2%，fold-80基础惩罚为1.32 + 0.01。

图2。KAPA UMI适配器支持高精度的分子计数和从10 ng cfDNA的双分子的高回收率。5个健康捐赠者的无细胞DNA样本和来自SeraCare的SeraSeq®ctDNA Complete™参考物质AF0.5%进行了重复测试，用于文库制备和KAPA HyperCap肿瘤面板(214 Kb捕获靶标)的靶标富集。使用KAPA HyperPrep试剂盒制备10 ng cfDNA文库，并根据KAPA HyperCap Workflow v1对每个样品进行一次杂交。在分析之前，从NextSeq™500系统中测序2 x 150 bp的聚类减少到每个样品5000万个经过过滤的高质量聚类。

1 Meyer, J，等。Roche应用说明SEQ100183。2018.

图3。独特的双索引减轻了在多路测序过程中索引错误分配对图案化流细胞的影响。该数据集中的每个点都代表一个无pcr的人类全基因组文库，在Illumina®HiSeq X仪器上以8个(黑色)或24个(蓝色)的池进行测序。用VerifyBamID计算的污染率反映了基于基因型分析的潜在样品交叉污染。索引跳跃有助于观察到的污染率，在实施KAPA UDI适配器中使用的非冗余双索引策略和条形码(而不是原来的单一索引工作流程)后，索引跳跃显著降低了污染率。绿线代表数据的平均值，红线代表数据的统计控制上限和下限，用JMP分析。数据由Broad研究所(Cambridge, MA, USA)提供。

图4。针对条形码交叉污染的KAPA适配器的基于测序的QC测试提高了结果的可信度。在这种内部开发的QC检测中，每个KAPA UDI适配器连接到一个独特的合成线性插入。这96个文库在Illumina NextSeq™500仪器上进行汇总和测序。在适配器修整和对准合成参考序列之前，每个库对数据进行下采样至500,000个读取。对齐的bam文件将向下采样到最后计算的最低对齐读计数。这里显示的热图是KAPA UDI适配器的代表性条形码交叉污染测试结果，并显示了与每个插入(列)和条形码(行)组合相关的读取百分比。对角线上的深绿色块对应正确的uddi插入组合。每个其他块对应于与96个集合中的其他期望索引组合之一相关联的特定插入的读取百分比，并根据右侧给出的刻度进行着色。测试确认了适配器被镀在正确的孔中，与其他潜在来源(如指数跳变)相比，由于无法过滤掉的UDI组合交叉污染造成的指数错配非常低^1。对KAPA UDI引物混合物进行了类似的内部开发的QC检测。