KAPA HyperPlus套件

图10。KAPA HyperPlus试剂盒可提高FFPE样品的覆盖率。使用KAPA HyperPrep Kit和Covaris试剂盒从200 ng FFPE DNA或50 ng匹配的正常对照(血液DNA)中制备文库^®剪羊毛，或KAPA HyperPlus工具包。使用自定义SeqCap执行两轮多路目标捕获^®EZ面板定位42个与胃肠道癌相关的基因区域。KAPA HyperPlus库的重复率显著降低，目标率略高，这意味着FFPE样本的覆盖深度显著增加。在covaris剪切DNA与酶切DNA库之间检测到预期频率≥5%的变异，且高度相关(R2 >0.96)。在Illumina MiSeq上进行配对端测序(2 x 150 bp)，并用Picard和Illumina VariantStudio v2.2分析数据。数据由皇家马斯登医院提供。

图11。KAPA HyperPlus试剂盒可提高FFPE样品的覆盖率。使用KAPA HyperPrep Kit和Covaris试剂盒从200 ng FFPE DNA或50 ng匹配的正常对照(血液DNA)中制备文库^®剪羊毛，或KAPA HyperPlus工具包。使用自定义SeqCap执行两轮多路目标捕获^®EZ面板定位42个与胃肠道癌相关的基因区域。KAPA HyperPlus库的重复率显著降低，目标率略高，这意味着FFPE样本的覆盖深度显著增加。在covaris剪切DNA与酶切DNA库之间检测到预期频率≥5%的变异，且高度相关(R2 >0.96)。在Illumina MiSeq上进行配对端测序(2 x 150 bp)，并用Picard和Illumina VariantStudio v2.2分析数据。数据由皇家马斯登医院提供。

图12。KAPA HyperPlus试剂盒可提高FFPE样品的覆盖率。使用KAPA HyperPrep Kit和Covaris试剂盒从200 ng FFPE DNA或50 ng匹配的正常对照(血液DNA)中制备文库^®剪羊毛，或KAPA HyperPlus工具包。使用自定义SeqCap执行两轮多路目标捕获^®EZ面板定位42个与胃肠道癌相关的基因区域。KAPA HyperPlus库的重复率显著降低，目标率略高，这意味着FFPE样本的覆盖深度显著增加。在covaris剪切DNA与酶切DNA库之间检测到预期频率≥5%的变异，且高度相关(R2 >0.96)。在Illumina MiSeq上进行配对端测序(2 x 150 bp)，并用Picard和Illumina VariantStudio v2.2分析数据。数据由皇家马斯登医院提供。

图14。KAPA HyperPlus在微生物全基因组测序的覆盖均匀性和GC偏差方面优于NEBNext和Nextera的工作流程。使用KAPA HyperPlus试剂盒，从3种细菌的1 ng基因组DNA中制备基因组GC含量范围内的文库;KAPA HyperPrep Kit with Covaris剪切;NEBNext dsDNA片段酶和NEBNext Ultra DNA文库准备试剂盒或Nextera XT DNA文库准备试剂盒(Illumina)。在Illumina MiSeq上进行配对端测序(2 x 300 bp)。

覆盖均匀性图。所有图书馆的数据都被降低采样到900,000次读取，并使用Bedtools计算覆盖率。HyperPrep和HyperPlus的工作流程产生了高度相似的覆盖分布，对所有三种细菌都有一个明显的峰值和可以忽略不计的尾部，表明覆盖均匀。相比之下，NEBNext和Nextera工作流程对GC含量不平衡的基因组产生了更广泛的分布，和/或模式覆盖深度较低。

图15。KAPA HyperPlus在微生物全基因组测序的覆盖均匀性和GC偏差方面优于NEBNext和Nextera的工作流程。使用KAPA HyperPlus试剂盒，从3种细菌的1 ng基因组DNA中制备基因组GC含量范围内的文库;KAPA HyperPrep Kit with Covaris剪切;NEBNext dsDNA片段酶和NEBNext Ultra DNA文库准备试剂盒或Nextera XT DNA文库准备试剂盒(Illumina)。在Illumina MiSeq上进行配对端测序(2 x 300 bp)。

覆盖均匀性图。所有图书馆的数据都被降低采样到900,000次读取，并使用Bedtools计算覆盖率。HyperPrep和HyperPlus的工作流程产生了高度相似的覆盖分布，对所有三种细菌都有一个明显的峰值和可以忽略不计的尾部，表明覆盖均匀。相比之下，NEBNext和Nextera工作流程对GC含量不平衡的基因组产生了更广泛的分布，和/或模式覆盖深度较低。

图17 Picard生成的GC-bias图。灰色直方图表示每个细菌的基因组GC含量的分布，以100 bp的bin为参考序列计算。通过绘制每个bin的标准化覆盖率来评估GC偏倚。如果所有样本到数据的过程(碎片化、适配器添加、库放大、聚类放大、测序和数据分析)都是完全无偏的，那么所有的箱子都将被平等地表示，即，每个工作流的图将是一个水平分布，中心是规范化覆盖率为1。对于艰难梭菌，HyperPrep和HyperPlus工作流程都获得了近乎完美的数据。相比之下，在NEBNext和Nextera艰难梭菌数据中，GC含量更平衡的垃圾箱(30 - 50% GC)的比例高于GC含量极低的垃圾箱(<30% GC)。与at丰富的区域相比，NEBNext和Nextera工作流通常在平衡和稍微富GC的区域(40 - 65% GC)表现更好。所有工作流程在百日咳杆菌的GC含量极高(>70% GC)的箱中表现不佳，其中测序技术固有的局限性开始占主导。

图18 Picard生成的GC-bias图。灰色直方图表示每个细菌的基因组GC含量的分布，以100 bp的bin为参考序列计算。通过绘制每个bin的标准化覆盖率来评估GC偏倚。如果所有样本到数据的过程(碎片化、适配器添加、库放大、聚类放大、测序和数据分析)都是完全无偏的，那么所有的箱子都将被平等地表示，即，每个工作流的图将是一个水平分布，中心是规范化覆盖率为1。对于艰难梭菌，HyperPrep和HyperPlus工作流程都获得了近乎完美的数据。相比之下，在NEBNext和Nextera艰难梭菌数据中，GC含量更平衡的垃圾箱(30 - 50% GC)的比例高于GC含量极低的垃圾箱(<30% GC)。与at丰富的区域相比，NEBNext和Nextera工作流通常在平衡和稍微富GC的区域(40 - 65% GC)表现更好。所有工作流程在百日咳杆菌的GC含量极高(>70% GC)的箱中表现不佳，其中测序技术固有的局限性开始占主导。