KAPA RNA HyperPrep试剂盒

KAPA RNA HyperPrep试剂盒包括RNA片段、cDNA合成、文库制备和扩增所需的所有试剂。KAPA纯珠提供在每个套件的反应清理，而KAPA适配器可单独提供。试剂盒还包括用于mRNA捕获(KK8580, KK8581)、rRNA耗尽(KK8560, KK8561)以及rRNA和珠蛋白耗尽(KK8562, KK8563)的前期耗尽模块。

1.一般

KAPA RNA HyperPrep试剂盒的推荐应用是什么?

为什么我要使用rRNA和/或珠蛋白消耗而不是mRNA捕获方法?

在mRNA捕获工作流中使用的poly(A)捕获方法在专门询问mRNA物种时是有用的，但该工作流确实偏向于外显子转录本。由于mRNA转录物的3'多聚腺苷酸化，poly(A)捕获方法也倾向于减少5'转录物的覆盖范围。

使用KAPA RNA HyperPrep试剂盒与RiboErase (HMR)和/或RiboErase (HMR)珠蛋白将允许更准确地表示整个转录组，并将包含除rRNA和/或珠蛋白外的所有RNA物种。该工作流程保留了内含子和基因间区域，这是许多长非编码转录本被发现的地方。此外，poly(A)捕获方法使其不适合用于降解RNA，在降解RNA中，3' polyadenylated区域和转录本的其余部分之间有可能出现链断裂。

我用的是KAPA搁浅rna测序试剂盒。我在哪里可以找到关于这些套件的更多信息?

如果您正在使用我们的KAPA搁浅RNA-Seq试剂盒，无论是mRNA捕获还是rRNA和/或球蛋白转录本耗尽，请访问我们的在线技术文档资源，或者请访问sequencing.roche.com/contactus。

2.兼容性

这些试剂盒是否与小RNA文库制备兼容?

不，这些试剂盒与小RNA不兼容。

这些试剂盒是否与ffpe衍生RNA兼容?

KAPA RNA HyperPrep试剂盒(不预先富集)和KAPA RNA HyperPrep试剂盒与核糖酶(HMR)和/或核糖酶(HMR)球蛋白兼容从福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)组织中提取的RNA。由于福尔马林固定过程的破坏性，可能会发生交联、化学修饰和碎片，ffpe衍生RNA的质量可能会有很大的变化。文库构建结果可能因RNA的输入量和质量而异。较高的RNA输入可以挽救文库的建设，特别是困难的FFPE样品。请参阅每个套件的技术数据表中列出的建议。

KAPA mRNA Hyper Prep试剂盒仅适用于高质量输入材料(RIN≥7)的mRNA捕获和文库构建。使用碎片RNA会导致mRNA 3 '端强烈偏向。

KAPA RNA HyperPrep试剂盒与哪些物种兼容?

KAPA RNA HyperPrep试剂盒(不预先富集)与任何物种兼容。KAPA mRNA HyperPrep试剂盒兼容于任何物种
3 ' poly-A尾巴。

KAPA RNA HyperPrep试剂盒与RiboErase (HMR)或RiboErase (HMR)球蛋白兼容人类，小鼠和大鼠rRNA和/或球蛋白转录本缺失。

KAPA RNA HyperPrep kit with RiboErase (HMR)和/或RiboErase (HMR) Globin是否会耗尽人、小鼠和大鼠物种的细胞质和线粒体rRNA ?

是的，细胞质和线粒体rRNA都被耗尽了。

KAPA RNA HyperPrep kit with RiboErase (HMR)和KAPA RNA HyperPrep kit with RiboErase (HMR) Globin有什么区别?

KAPA RNA HyperPrep Kit with RiboErase (HMR)和KAPA RNA HyperPrep Kit with RiboErase (HMR) Globin使用相同的工作流程和试剂，这允许从人类、小鼠和大鼠物种中消耗rRNA。唯一的区别是，在工作流程的初始杂交步骤中，提供并添加了一管额外的耗尽寡核苷酸，以在使用KAPA RNA HyperPrep Kit with RiboErase (HMR) globin时耗尽球蛋白转录本。这些球蛋白消耗寡核苷酸靶向来自血红蛋白α 1 (HGA1)、血红蛋白α 2 (HGA2)、血红蛋白β (HGB)和血红蛋白γ (HGG)的血红蛋白mRNA。

3.工作流

RNA HyperPrep试剂盒的主要工作步骤是什么?

• 利用热和镁破碎;
• 随机引物法合成第一链cDNA
• 结合第二链cDNA Synthesis和a - tailed，将cDNA:RNA杂交转化为双链cDNA (dscDNA)，在第二链中加入dUTP，并在dscDNA文库片段的3 '端添加dAMP;
• 适配器连接，将3 ' -dTMP悬垂的dsDNA适配器连接到a尾文库插入片段;而且
• 文库扩增使用高保真、低偏置PCR扩增两端携带适当适配器序列的文库片段。标记有dUTP的链没有被放大，允许链特异性测序。

用于mRNA捕获的前端富集模块使用磁性寡聚dt珠。rRNA和/或珠蛋白缺失包括互补DNA寡核苷酸的杂交，然后用RNase H和DNase处理，分别去除复制成DNA和原始DNA寡核苷酸的rRNA和/或珠蛋白转录本。

KAPA RNA HyperPrep试剂盒的输入要求是什么?

什么是KAPA纯珠?

KAPA纯珠提供在这个试剂盒的反应纯化步骤。它是一种顺磁珠悬浮在缓冲液中，用于下一代测序和其他分子生物学工作流程的纯化。KAPA纯珠子兼容手动处理或自动液体处理，并实现两种格式的高效回收。

试剂盒是否提供特定于鱼股的信息?

是的，在第二链合成过程中，cDNA:RNA杂交基因被转化为dscDNA, dUTP被合并到第二链中。在文库扩增过程中，含有dUTP的链不被扩增，允许链特异性测序。该试剂盒在˃99%的唯一映射读取中保留了准确的链起源信息。

在样品制备过程中是否有安全的停止点?

样品制备过程可以在前置耗尽模块后安全暂停，如下所示:

mRNA捕获后，重悬珠(在22 μL的Fragment, Prime和Elute Buffer中)可在4℃下保存≤24小时。
rRNA和/或珠蛋白耗尽后，在1X片段、Prime和洗脱缓冲液中洗脱后，样品可在-20°C下保存≤24小时。

从RNA片段到文库扩增的文库构建过程可以在大约4小时内完成，具体时间取决于正在处理的样本数量和经验。如有必要，协议可以在以下任何步骤后安全暂停:

• 在第一次结扎后清理后，将重悬的珠子在4°C保存长达24小时。不要冷冻珠子，因为这可能会导致DNA的急剧损失。
• 结扎后第二次清理后，将洗脱后未扩增的文库DNA在4℃保存≤1周，或在-20℃保存≤1个月。

这个试剂盒使用的是什么RNA碎片的方法?

RNA在镁存在的高温下被裂解。根据输入RNA的来源和完整性，以及预期的应用，提供不同的RNA碎片协议以获得所需的插入大小分布。对于完整的RNA，例如从新鲜/冷冻组织中提取的RNA，在更高的温度下需要更长的破碎时间。对于降解或碎片化的RNA(例如来自较旧的样品或FFPE组织)，使用较低的温度和/或较短的时间。每种产品的技术数据表根据输入RNA和所需的插入尺寸概述了各种片段参数。

我可以使用什么适配器与KAPA RNA HyperPrep试剂盒?

KAPA双索引适配器推荐与KAPA RNA Hyper Prep试剂盒一起使用。然而，这些工作流也与其他全长适配器设计兼容，其中测序和簇生成序列都在连接步骤中添加，例如Illumina TruSeq、SeqCap EZ、Agilent SureSelect XT2和其他类似的库构建工作流中常规使用的那些。

也可以使用具有类似设计并与dsDNA的“TA-ligation”兼容的自定义适配器，请记住，自定义适配器设计可能会影响库构建效率。截断的适配器设计，其中簇生成序列是在扩增而不是结扎期间添加的，可能需要修改结扎后的清理条件。有关适配器兼容性的帮助，请与我们联系。

我在哪里可以找到更多关于KAPA双索引适配器的信息?

有关不同KAPA RNA HyperPrep试剂盒和输入的条形码序列、池化、试剂盒配置、配方和稀释的信息，请参阅KAPA双索引适配器技术数据表。

接头连接cDNA可以储存多长时间?

在扩增和/或测序之前，纯化的、适配器连接的cDNA可在4°C保存一周或在-20°C保存至少一个月。为了避免降解，始终将DNA存储在缓冲溶液(10mm Tris-HCl, pH 8.0)中，并尽量减少冻融循环次数。

在KAPA RNA HyperPrep试剂盒中使用哪种聚合酶进行扩增?

KAPA HiFi HotStart DNA聚合酶是KAPA HiFi HotStart ReadyMix中的酶，在KAPA RNA HyperPrep试剂盒中提供。这是一种用于低偏置、高保真PCR的新型b家族DNA聚合酶，是NGS文库扩增的首选试剂1、2、3、4。

1. Oyola, S.O.等人。BMC Genomics 13, 1(2012)。
2. 鹌鹑，M.A.等。自然科学进展(2012)。
3. 鹌鹑，M.A.等。BMC Genomics 13, 341(2012)。
4. 罗斯，M.G.等人。《中国生物科学》(2013)。
   

在放大我的适配器连接库时，我应该使用多少个循环?

为了最大限度地减少过度扩增和相关的不需要的产物，应根据Illumina仪器的要求，优化PCR循环的数量，以产生足够的最终扩增文库，用于下游分析和质量控制。对于目标捕获工作流程，通常需要1µg的库良率，这可能取决于所使用的方法和所采用的预捕获多路复用策略。

每个KAPA RNA HyperPrep Kit的技术数据表中推荐的循环数应作为文库扩增的指南，但循环数可能必须根据所需的最终文库产量、文库扩增效率、RNA片段分布和适配器二聚体的存在进行调整。

我应该如何测量最终的库?

dscDNA和/或最终扩增文库的大小分布应用电泳方法确认。文库的定量应使用基于qPCR的定量试剂盒进行，如Illumina平台的KAPA文库定量试剂盒。该试剂盒采用基于Illumina流细胞寡核苷酸的引物，可用于定量流细胞扩增文库。

4.数据分析

分析我的KAPA RNA HyperPrep数据的最佳方法是什么?

罗氏测序解决方案与Genialis合作，提供数据分析和可视化平台，专门为KAPA RNA HyperPrep试剂盒进行验证。这为我们的客户提供了简单、可靠和完整的端到端RNA工作流程。这种基于云的数据分析解决方案允许跟踪每个处理步骤，以确保数据、项目和协作的质量和可重复性以及管理。

Genialis平台的优势包括:

• 通过在云托管的计算资源中运行经过验证的、单击一次的生物信息学管道，建立跨项目的可重复性，以便在跨项目中以相同的方式执行主要数据分析。
• 验证您的实验重复之间的一致性，并确定实验条件之间的相关相关性或差异，以确保设计质量。
• 通过量化个体样本中的基因丰度来比较不同条件下的表达水平，并研究个体基因、预定义基因集和整个转录组的差异表达。
• 了解特定的实验条件如何影响相关基因群的调控及其相应的生物学功能。
  
  

5.存储和质量控制信息

这个工具箱的储存条件是什么?

KAPA RNA HyperPrep试剂盒在多个盒子中提供。

• cDNA合成和文库制备的组分对温度敏感，收到后应在-15°C至-25°C恒温冰箱中保存。PEG/NaCl溶液可在4°C保存2个月或在-20°C保存至有效期。
• 接收后，用于mRNA捕获的前期富集模块应存储在2°C至8°C，用于rRNA和/或珠蛋白耗尽的前期富集模块应存储在-15°C至-25°C。
• KAPA纯珠子储存在2°C至8°C。

当在这些条件下储存并正确处理时，试剂盒组件将保持完全活性，直到试剂盒标签上显示的有效期。

对KAPA适配器进行什么QC测试?

KAPA适配器经过广泛的qPCR和基于测序的功能和QC测试，以确认:

• 优化图书馆建设效率
• 最低水平的适配器二聚体形成
• 条形码交叉污染的名义水平

在低输入库构建工作流中评估库构建效率和适配器二聚体的形成。文库构建效率通过qPCR(使用KAPA文库定量试剂盒)测量适配器连接文库(在任何扩增之前)的产量来计算，并将其表示为输入DNA的%。为了评估适配器二聚体的形成，使用了一种改进的库构建协议-设计用于测量适配器二聚体具有高灵敏度。本试验的合格标准转化为在标准工作流程中0 - 2%范围内的适配器二聚体结转。

通过测序评估条形码交叉污染。每个适配器使用标准库构造协议连接到一个已知序列的唯一合成插入。库在MiSeq™上进行池化和排序。对于每个条形码，计算与96个插入中的每个相关的读取次数(至少115,000次)，并计算正确插入的总百分比。任何条形码与任何其他单一条形码的污染保证小于0.25%。任何条形码的总污染水平通常在0.1 - 0.5%的范围内。该方法无法区分化学交叉污染和适配器“串扰”，并测量由这两种现象导致的不正确插入的总数。当条形码在测序和随后的分析过程中被“误读”时，就会发生适配器“串扰”。“串扰”的倾向因不同的适配器对而不同，并取决于条形码序列的关联程度。

KAPA适配器稀释缓冲液无可检测的污染外切酶和内切酶活性，并满足严格的DNA污染要求。