KAPA文库定量试剂盒

KAPA文库定量试剂盒是如何工作的?

标准曲线的生成及文库浓度的定量

使用针对适配器序列的平台特异性qPCR引物扩增六个预稀释的DNA标准品和适当稀释的NGS文库。将每种DNA标准品的平均Cq值与其已知浓度相对应绘制成一条标准曲线。使用标准曲线将稀释后的库的平均Cq值转换为浓度，由此计算出每个库的工作浓度。

为什么定量PCR比NGS文库定量的标准方案更好?

所有三个主要的商业下一代测序(NGS)平台的标准协议采用不可靠、费力和昂贵的方法，在测序模板克隆扩增之前定量文库DNA分子。通过桥式PCR (bPCR)进行可靠的克隆扩增，准确定量真正的PCR胜任测序模板至关重要;“聚类扩增”)或乳液PCR (emPCR)——低估会导致非克隆和/或过度聚类，而高估会导致聚类或携带模板的珠粒产量低。

大多数量化NGS库的标准方法都有一些重要的缺点。首先，电泳和分光光度法测量总核酸浓度，而最佳簇密度或模板-珠比取决于pcr扩增DNA模板的适当输入浓度。由于库中可扩增DNA分子的比例可能随每个样品而变化，因此需要进行昂贵且耗时的滴定。其次，这些方法灵敏度低，需要消耗毫微克的珍贵样品，或者比测序所需的分子多1000倍。最后，电泳和分光光度法不适合样品的高通量，需要费力和容易出错的人工液体处理。

为什么定量qPCR天生就适合于NGS文库的定量?

• 具体定量pcr胜任DNA分子
• 准确跨越非常广泛的动态范围
• 适用于自动液体处理
• 具有成本效益的
• 允许精确定量非常稀的文库
• 消耗少量样品

为什么使用基于qpcr的KAPA文库定量试剂盒方法和基于Agilent生物分析仪/Invitrogen量子比特/分光光度法的方法获得的浓度存在差异?

我们认为，qPCR定量文库是最大限度地减少变异簇密度或头富集的最佳方法。除了数据收集、处理和/或分析中的错误外，这种差异有三种可能的解释:

• qPCR只“计数”那些能胜任PCR模板的文库分子，因此对所有在emPCR过程中从扩增簇到携带扩增测序模板的珠的桥式PCR过程中不能产生簇的文库分子视而不见。因此，我们发现qPCR通常提供的文库浓度估计值低于特异性较低的方法，如Agilent生物分析仪或染料辅助分光光度法，如Picogreen。
• 移液精度是所有文库定量方法中常见的误差来源，特别是当测量小体积时，以及进行连续稀释时。由于qPCR高度敏感，只需要少量的样品，并且利用低反应体积(在其他方面的所有优点)，因此密切关注所使用设备的质量和条件尤为重要。
• 生物分析仪准确度:使用相关生物分析仪DNA测定定量的规定变异系数为20%。此外，根据我们的经验，生物分析仪分析容易出现不稳定的行为，这取决于仪器维护、试剂使用时间和储存条件、操作失误等。其他可能影响生物分析仪定量的因素与文库片段的大小分布有关。有可能用于确定要量化的峰的大小截止值可能会排除片段，特别是在较小的一端，这可能会产生团簇或富集的小珠。同样，计算基线位置的一个相对较小的变化，和/或仪器/分析的检测限，可能会低估或高估大小分布两端的大量文库片段。

我可以用一个工具包量化多少个文库?

单个KAPA文库定量试剂盒足以定量~30个文库(按照我们推荐的96孔格式的方案)。然而，更多的库可以使用以下方法进行量化:

• 384孔板格式，
• 反应体积更小，
• 稀释次数较少，和/或
• 更少的复制。

许多变量将极大地影响每个工具包可以量化的库的最终数量。以下是基于我们推荐的协议细节的一些指导方针:

• 每次分析只需要运行一组(最好是三份)6个DNA标准。

复制*	稀释/ 库* *	#库/设备: 96 * * *	#库/设备: 384 * * * *	数据的可靠性
3.	3.	36	94	非常高的
3.	2	59	143	高
3.	1	118	287	可以接受，但会增加重复的风险
2	3.	63	145	高
2	2	95	218	可以接受，但会增加重复的风险
2	1	190	437	可以接受，但会增加重复的风险

*我们建议对DNA标准品和文库样品进行三次反应;然而，一些用户可能会有足够的信心，特别是在使用试剂盒的一些经验之后，放弃一些标准品和/或样品的复制。这将使难以或不可能排除任何意外结果，并可能影响定量准确性;另一方面，使用相同数量的试剂可以定量更多的文库。

**我们建议您对每个文库样品进行三次连续稀释，以确保至少一次稀释在检测范围的上限内。这也允许计算特定文库样本的qPCR效率。因此，有了经验和/或非常标准化的工作流程，您可能有信心停止进行这些连续稀释，在这种情况下，每次定量所需的qPCR反应数量将减少。

***如果您一次定量一个文库样本，您将能够定量每个DNA标准试剂盒六个文库。每次定量实验将使用6 × 3个qPCR反应作为标准品，加上4 × 3个qPCR反应用于文库样品=总共30个qPCR反应。由于每个试剂盒包含5ml KAPA SYBR FAST 2X qPCR Master Mix(足够500 × 20 μL反应)，当您完成DNA标准品时，您将有500 μL - (6 × 30 μL) = 320 qPCR反应剩余。在这种情况下，可以单独购买额外的DNA标准品，这样剩余的qPCR试剂就不会浪费。

****用户可以选择运行10 μL的卷(特别是384孔格式)。无论反应体积大小，每次反应中加入的DNA标准品体积均为4 μL。

数据点误差和可变性的主要原因是什么?

不准确的液体处理是造成可变性的最常见原因。准确的定量需要仔细移液。对于液体处理系统，请参阅相关的用户手册。或者，当使用非自动化设备时，应用以下方法:

• 在组装qpcr之前，请确保所有试剂完全解冻并彻底混合。
• 解冻和混合后，短暂离心试剂，以防止管壁上的液滴转移到移液管尖端的外部。
• 浓缩的DNA溶液是粘性的，因此很难分配小体积的DNA。在移液前确保库和控件完全混合。
• 稀释文库和对照时，使用推荐的稀释缓冲液(10mM Tris-HCl, pH 8.0(25˚C) + 0.05% tweens -20)。吐温-20是一种湿润剂，可提高移液精度。不要在水中稀释文库，因为DNA在pH值为bb70时对水解很敏感。
• 配药前检查药头，确保加入的药量正确。
• 配药后冲洗/冲洗针尖2-3次。
• 每次使用新的吸管头。
• 当吸气时，尽量避免将移液管尖端放置在表面下方太远，因为这可能会导致额外的液体粘附在尖端的外部。
• 直接分配到管的底部或井。
• 确保点胶后尖端没有残留液体。

标准品和库的污染也会导致化验中的错误。我们建议:

• 良好的实验室操作规范，避免试剂、样品、耗材、移液器和其他设备受到污染;和
• 连续标准品的扩增曲线间距系统性地减小，可能表明外源模板污染或稀释的DNA标准品被更浓缩的标准品污染。为了避免后者，将DNA标准品从最低浓度分配到最高浓度(DNA标准品6到DNA标准品1)，并使用新鲜的尖端。

为什么DNA标准1(和/或我的一些库样本)的Cq太低(扩增太早)?

由于KAPA文库定量分析的设计规范和广泛的动态范围，DNA标准1具有比典型qPCR分析的样品更高的拷贝数，特别是在相对定量分析中。因此，标准1(和任何未充分稀释的样品)在qPCR仪器自动基线测定期间可能返回非常早的Cq评分和/或荧光信号增加。许多仪器使用早期周期来计算和设置基线减/校正，并且在此阶段荧光显着变化的样品会极大地影响该过程(因为没有稳定的基线)。

通常可以通过检查放大图来判断这是否是一个问题。如果校正/处理后的扩增图开始时远低于越过Cq的样品的基线，则该图的基线测定/减法可能不成功。判断早期Cq值是否在数据分析过程中产生问题的另一个有用方法是确认连续标准之间的预期间隔为~3.32个周期(标准代表10倍稀释序列)。同样地，给定样品的连续两倍稀释应该跨越Cq ~1周期。

如果您觉得第一个标准和/或一些样本稀释液的Cq分数太早，那么只需从分析中排除该标准和这些样本稀释液。这是最容易做到的，在qPCR分析软件中去选择它们。如果您在仪器/设置/工作流程中经常遇到此问题，那么您可以选择在所有未来的分析中省略第一个DNA标准，并且您可能需要考虑在标准工作流程中对库样品进行更大的预先稀释。如果省略第一个标准，请确保库的Cq分数在标准2-6的动态范围内。

我应该使用什么指导方针来检查我的标准曲线?

在检查DNA标准的数据时，首先应该看两件事:

• 连续标准之间的间隔:每对DNA标准(例如标准1和标准2，或标准2和标准3)之间的平均值ΔCq值在3.1到3.6之间。如果ΔCq始终在范围之外，这可能表明移液准确性或qPCR反应效率存在问题。
  计算的反应效率在90 ~ 110%范围内，R2≥0.99。如果试验返回的反应效率在可接受范围内，但在同一qPCR仪器上常规达到的值有超过3%的变化，这可能表明意外的设备变化，应在接受结果之前予以考虑。
• 重复之间的差异:1 Cq的差异相当于模板浓度的2倍差异。如果任何复制的Cq分数与其他两个值的差异大于+/- 0.25，则应该丢弃它。0.25取决于仪器，可以根据您的特定仪器确定。大于这个值的差异可能表明仪器在井间存在很大程度的差异(光学和/或温度控制)，或者移液精度存在问题。
  
  虽然丢弃偶尔的“异常值”是可以接受的，但大量的“异常值”通常表明qPCR仪器或液体处理设备和/或技术存在问题。此外，Cq值将根据所使用的qPCR仪器和阈值设置而显着变化。

为什么KAPA文库定量试剂盒方案中推荐的循环方案与KAPA SYBR FAST qPCR试剂盒方案不同?

下一代测序文库通常是复杂的，包含非常广泛的DNA片段。虽然KAPA SYBR FAST qPCR试剂通常能够极快的热循环，但我们保守地建议相对较长的变性和退火/延长时间进行文库定量，以适应典型文库样本中模板的多样性。文库定量的推荐qPCR方案包括在95°C下初始变性步骤5分钟，然后在95°C下变性35次循环30秒，然后在60°C下组合退火/延伸45秒。如果文库片段的平均大小为>700 bp，则将退火/延伸时间增加到90秒。

qPCR文库定量后的熔体曲线分析能否用于文库质量监控(即检测适配体二聚体、平均片段大小、文库复杂性等)?

熔体曲线分析通常包括在基于SYBR Green i的qPCR分析结束时，以提供有关反应特异性的信息。在文库定量分析中，熔体曲线分析的相关性较小，因为被扩增的模板不是由确定长度和GC含量的单个DNA片段组成的，而是由具有一定长度和GC含量范围的异质分子组成的。与单个扩增子的熔化曲线不同，Illumina文库的熔化曲线是一种“复合”分析，代表整个文库片段种群的平均值。同样重要的是要记住，文库样品预计将相对较早地达到其量化周期(Cq)，而熔体曲线分析仅在35个周期后进行，即在衬底耗尽发生并且扩增伪影不再代表原始模板的时候。这使得在文库定量分析中产生的熔体曲线的解释变得复杂。

尽管如此，我们发现熔体曲线分析对于在Illumina文库中识别结转适配器二聚体是有用的。在库构建过程中形成的全长适配器二聚体，在KAPA库定量分析中被非常有效地放大，如果大量存在，将导致库浓度的高估。主库峰右侧的第二个温度较高的小峰表示适配器二聚体。请注意，用于Illumina平台的KAPA文库定量试剂盒中包含的DNA标准品的熔化曲线显示非常典型的双峰。这是在452bp线性标准中不同的局部熔化的结果。

各种KAPA文库定量试剂盒中使用的引物序列是什么?

Illumina公司

引物P1: 5 ' -AAT GAT ACG GCG ACC ACC GA-3 '
引物P2: 5 ' -CAA GCA GAA GAC GGC ATA GCA -3 '

离子激流

引物IT A: 5 ' -CCA TCT CAT CCC TGC GTG TC-3 '
引物IT trP1: 5 ' -CCT CTC TAT GGG CAG TCG GTG AT-3 '

应用生物系统固体

引物P1: 5 ' - CCA CTA CGC CTC CGC TTT CCT CTC TAT G - 3 '
引物P2: 5 ' - CTG CCC CGG GTT CCT CAT TCT - 3 '

如何控制KAPA文库定量试剂盒中的DNA标准品以最小化批间差异并确保可靠性?

在我们的文库定量试剂盒中使用的DNA标准不是测序文库，而是每组DNA标准的定义，纯，线性，dsDNA扩增子。这使我们能够严格验证它们作为qPCR扩增标准的效率和可重复性。在接受新制造的批次进入我们的库存之前，我们在制造和质量控制期间使用严格的qPCR检测将每个新批次的KAPA Library Quantification DNA标准与参考标准进行比较。我们将新制造的一组标准中的每种标准的Cq分数与参考标准中的Cq分数进行比较，并确保每种标准与各自参考标准的Cq值在0.1 Cq内，并且所得标准曲线基本上位于参考标准曲线的顶部(y截距和斜率的最小偏差)。

KAPA文库定量试剂盒的推荐储存方式是什么?

根据目的地国家，KAPA库定量试剂盒以干冰或冰袋运输。收到后，将整个试剂盒保存在-20°C的恒温冰箱中。当在这些条件下储存并正确处理时，所有试剂盒组件将从收到之日起至少保持六个月的完整活性。

KAPA库定量试剂盒的所有成分-以及组合的KAPA SYBR FAST/引物预混溶液-通过30多次冷冻/解冻循环保持稳定。因此，我们建议所有试剂在不使用时在-20°C的暗箱中保存。然而，这些试剂在4°C的黑暗中至少一周是稳定的，只要它们没有被微生物和/或核酸酶污染，就可以在这种状态下储存短期使用。

我应该在我的分析中添加多少量的低/高ROX ?

对于某些实时循环仪，ROX参考染料的存在补偿了荧光检测中与非pcr相关的变化。ROX参考染料的荧光水平在实时PCR过程中没有明显变化，但为PCR相关荧光信号的归一化提供了稳定的基线。因此，ROX染料补偿了由于反应体积的微小变化或井位的差异而导致的井间荧光检测的差异。主混合物中ROX染料的存在不会干扰任何仪器上的实时PCR，因为染料不参与反应，并且其发射光谱与SYBR Green i不同。如果使用带有通用qPCR主混合物的试剂盒，并且总是只使用ROX High或ROX low，则在打开qPCR主混合物时，可以将整个200µL合适的ROX溶液添加到qPCR主混合物中。如果要单独添加ROX，则在每次检测中添加0.4 μL的50X ROX High/Low。