仅供研究使用。不用于诊断程序。
KAPA RNA HyperPrep套件利用一种新型化学的结合,使酶步骤和更少的反应方法进行了净化,导致一个真正的解决方案准备高质量的RNA-seq库。strand-specific工作流是灵活的,支持图书馆建设低投入数量和退化的样品和兼容mRNA捕获和核糖体核糖核酸和/或球蛋白成绩单损耗。
每个KAPA RNA HyperPrep组件包括相同的核心库和一个可选的前期建设化学损耗模块,组成四个工作流解决方案:要么mRNA捕获,核糖体RNA损耗、核糖体RNA和球蛋白损耗或没有。罗氏公司测序解决方案提供了一个完整的图书馆准备解决方案KAPA纯珠子(包括)和KAPA Dual-Indexed适配器(分别提供)。这些工具被设计成automation-friendly大多数商用液体处理程序。
查看KAPA RNA HyperPrep工作流和测序目标取决于应用程序
图2。KAPA RNA HyperPrep包提供一个流线型,多才多艺的核心图书馆建设解决方案,这可能是结合各种浓缩选项之前或之后图书馆准备。根据样品类型和实验设计,不必要的核糖体rna和/或其他记录(如球蛋白在血液样本)可能保持酶的枯竭使用KAPA RiboErase包、或聚(A)尾随信使rna可能选择KAPA mRNA在图书馆建设之前捕获工具。另外,总RNA库可能准备和编码和非编码内容选择杂交捕获、使用SeqCap EZ探针和变容二极管的工作流程。
查看流线型,strand-specific图书馆建设KAPA RNA HyperPrep工具包提供的工作流。
图3。这部小说化学受雇于KAPA RNA HyperPrep工具包允许更少的酶和清理步骤,这样可以减少实际和整体图书馆准备时间。RNA损耗与KAPA RiboErase (HMR)或KAPA RiboErase (HMR)球蛋白包增加了总流程时间约2.5小时,而KAPA mRNA捕获工具增加了大约1.5小时。整个工作流程,从输入RNA sequencing-ready库可以很容易地在一个标准的工作日完成。竞争对手工作流需要一个额外的1.5 - 2小时。所有KAPA RNA-Seq automation-friendly图书馆建设工作流程。
查看性能数据显示高效转换的输入使用KAPA RNA RNA adapter-ligated图书馆HyperPrep用品丰富了核糖体RNA损耗或mRNA捕获。
图4。KAPA RNA HyperPrep包(绿色)使高效转换的输入RNA(丰富了rRNA损耗或mRNA捕获)adapter-ligated库。更高的最终库收益率(A)是用更少的周期放大来实现的,而工作流从不同的供应商(灰色)。因为更少的读取与不必要的相关内容(PCR副本,B;和残余rRNA, C),一个更大比例的测序数据与感兴趣的成绩单(D)相关联。
人类普遍引用的库是由不同的输入(表)RNA(安捷伦科技),指控在x轴上的每个图,使用一个rRNA损耗工作流(左)或mRNA捕获(右)在图书馆建设。每个工作流的最低输入(5 ng rRNA枯竭和10 ng mRNA捕获)5倍低于推荐的最低输入KAPA RiboErase和KAPA mRNA捕获工作流,分别。Paired-end (2 x 100 bp)测序进行Illumina公司HiSeq 2500乐器。数据被业者1500万读/样本进行分析。每个酒吧代表三个技术复制的平均值。转录丰度量化了pseudomapping反对人类转录组,使用Kallisto。
查看性能数据显示改善覆盖均匀使用KAPA RNA HyperPrep用品丰富的核糖体RNA损耗或mRNA捕捉。
图5。高效的RNA浓缩,通过核糖体RNA损耗或mRNA捕获、一起优化图书馆建设导致更高和更甚至覆盖在记录长度。
图书馆是来自25 ng (rRNA损耗)或50 ng (mRNA捕获)高质量的表RNA使用制造商的标准工作流程的建议,在可能的情况下。(A)为1000年最有表达了成绩单,KAPA工作流导致更覆盖在整个记录长度,相比工作流从其他供应商。这是明显的从标准化覆盖率情节和覆盖变异系数(CV)。KAPA RNA HyperPrep工作流,雇佣KAPA HiFi图书馆放大,也更好的保存困难GC-rich区域(红色)中概述,强调了在YBX1 IGV块选择地区(B)和SLC2A4RG (C)基因。
查看性能数据显示改善覆盖均匀使用KAPA RNA HyperPrep用品丰富的核糖体RNA损耗或mRNA捕捉。
图6。KAPA RNA HyperPrep包提供一个流线型,多才多艺的核心图书馆建设解决方案,这可能是结合各种浓缩选项之前或之后图书馆准备。
Genialis提供单击,自动化的数据分析和可视化平台,已专门为KAPA RNA HyperPrep工具进行验证。
*数据文件。
下表描述了规范KAPA RNA HyperPrep工具包,包括所有四个工作流:
| 规格 | KAPA RNA HyperPrep工具包 | KAPA mRNA HyperPrep工具包 | 与RiboErase KAPA RNA HyperPrep工具包(HMR) | 与RiboErase KAPA RNA HyperPrep工具包(HMR)妖精(血液样本) | |
| 兼容的平台 | 所有Illumina公司测序仪器 | ||||
| 输入 | 1 ng - 100 ng | 50 ng - 1µg | 25 ng - 1µg | 25 ng - 1µg | |
| 输入类型 | 高质量的总RNA | 推荐 | |||
| 低质量的总RNA(例如FFPE RNA) | 兼容的 | 不推荐 | 兼容的 | 兼容的 | |
| 保利(A)二十三和/或枯竭的RNA | 推荐 | N /一个 | N /一个 | N /一个 | |
| 样本类型 | 物种 | 真核生物、微生物、植物等。 | 真核生物、植物等。 | 人类,老鼠,老鼠 | |
| 工作流 | 碎片 | 可调 | |||
| 图书馆准备时间 | 4小时 | 5.5小时 | 6.5小时 | 6.5小时 | |
| 自动化友好 | 是的 | ||||
KAPA RNA HyperPrep工具包包含所有所需试剂RNA片段,互补脱氧核糖核酸的合成,图书馆准备和放大。KAPA纯珠子是每个工具包中提供反应清理,而KAPA适配器分别是可用的。包还包括前期损耗模块mRNA捕获(KK8580 KK8581),核糖体rna损耗(KK8560 KK8561),核糖体rna和球蛋白损耗(KK8562 KK8563)。
| 设备代码 |
罗氏的猫。没有 |
描述 |
包大小 |
|---|---|---|---|
| KK8540 |
08098093702 |
KAPA RNA HyperPrep工具包 |
24岁的库 |
| KK8541 |
08098107702 |
KAPA RNA HyperPrep工具包 |
96库 |
| KK8580 | 08098115702 |
KAPA mRNA HyperPrep工具包 | 24岁的库 |
| KK8581 | 08098123702 |
KAPA mRNA HyperPrep工具包 |
96库 |
| KK8560 | 08098131702 |
与RiboErase KAPA RNA HyperPrep工具包(HMR) |
24岁的库 |
| KK8561 | 08098140702 |
与RiboErase KAPA RNA HyperPrep工具包(HMR) |
96库 |
| KK8562 | 08308314702 | 与RiboErase KAPA RNA HyperPrep工具包(HMR)球蛋白 |
24岁的库 |
| KK8563 | 08308241702 | 与RiboErase KAPA RNA HyperPrep工具包(HMR)球蛋白 |
96库 |
所有KAPA适配器套件包含KAPA适配器稀释缓冲和三个额外的密封电影来支持多个使用。KAPA适配器分别稀释缓冲(08278539001)也可以,如果需要的话。
| 设备代码 |
罗氏的猫。没有 |
描述 |
包大小 |
|---|---|---|---|
| KK8727 | 08861919702 | KAPA独特Dual-Indexed适配器套件(15μM) | 96年x 20μL适配器 |
| KK8721 |
08278539001 |
KAPA适配器稀释缓冲(25毫升) |
25毫升 |
有什么推荐的申请KAPA RNA HyperPrep包吗?
我为什么要使用核糖体rna和/或球蛋白消耗在一个信使rna捕获方法?
聚()方法用于一个信使rna捕获专门询问时,工作流是有用mRNA物种,然而工作流并偏向其实记录。保利(A)捕获方法也往往减少了5的成绩单的报道,由于3聚腺苷酸化的mRNA转录。
KAPA RNA HyperPrep工具包的使用与RiboErase (HMR)和/或RiboErase (HMR)球蛋白将允许一个更准确的表示整个转录组,并将包含所有的RNA物种除了rRNA和/或球蛋白。此工作流保留intronic和基因间区域,这是许多长非编码记录发现的地方。此外,聚(A)捕获方法使得它不兼容使用退化的RNA,哪里有链断裂的可能性之间的3 '腺苷地区和其他记录。
我使用KAPA困RNA-Seq包。我在哪里找到关于这些工具的更多信息?
如果您使用的是我们的一个KAPA滞留RNA-Seq包、mRNA捕获或rRNA和/或球蛋白成绩单损耗,请访问我们的网上资源或者技术文档,请访问sequencing.roche.com/contactus。
这些包兼容的小RNA图书馆准备吗?
不,这些工具不兼容小RNA。
这些包兼容FFPE-derived RNA吗?
KAPA RNA HyperPrep工具包(没有前期浓缩)和KAPA RNA HyperPrep包RiboErase (HMR)和/或RiboErase (HMR)球蛋白兼容RNA提取formalin-fixed石蜡包埋组织(FFPE)。FFPE-derived RNA可以高度的质量变量由于破坏自然的福尔马林固定过程中,交联,化学改性,会发生分裂。图书馆建设结果可能取决于输入的数量和质量的RNA。更高的RNA输入可能挽救图书馆建设特别困难FFPE样本。请参阅技术数据表中列出的建议为每个设备。
KAPA mRNA超级准备包只适合mRNA捕获和图书馆建设从高质量的输入材料(RIN≥7)。使用分散的RNA会导致强烈的偏向mRNA的3 '端。
与物种KAPA RNA HyperPrep包兼容的?
KAPA RNA HyperPrep工具包(没有前期浓缩)兼容任何物种。KAPA mRNA HyperPrep包兼容任何物种
3 '多聚腺苷酸尾。
与RiboErase KAPA RNA HyperPrep工具包(HMR)或RiboErase (HMR)球蛋白兼容人类,老鼠,老鼠rRNA和/或球蛋白成绩单损耗。
做KAPA RNA HyperPrep包RiboErase (HMR)和/或RiboErase (HMR)球蛋白耗尽细胞质和线粒体核糖体RNA人类,老鼠和老鼠物种?
是的,细胞质和线粒体核糖体rna是耗尽。
之间的区别是什么KAPA RNA与RiboErase HyperPrep工具包(HMR)和KAPA RNA与RiboErase HyperPrep工具包(HMR)球蛋白?
KAPA RNA与RiboErase HyperPrep工具包(HMR)和RiboErase KAPA RNA HyperPrep工具包(HMR)球蛋白使用相同的工作流和试剂,它允许的损耗rRNA从人类、老鼠和老鼠的物种。唯一的区别在于,提供一个额外的管损耗寡核苷酸和添加在最初的杂交步骤工作流程,耗尽球蛋白成绩单当使用KAPA RNA与RiboErase HyperPrep工具包(HMR)球蛋白。这些球蛋白损耗目标来自血红蛋白α1球蛋白信使rna寡核苷酸(HGA1)、血红蛋白α2 (HGA2),β血红蛋白(HGB),血红蛋白γ(HGG)。
有哪些主要工作流步骤RNA HyperPrep包吗?
信使rna的前期浓缩模块捕获利用磁oligo-dT珠子。核糖体rna和/或球蛋白损耗包括互补DNA寡核苷酸杂交、其次是核糖核酸酶治疗H和DNase移除rRNA和/或球蛋白成绩单双工原始DNA和DNA寡核苷酸,分别。
的输入要求KAPA RNA HyperPrep包吗?
KAPA纯粹的珠子是什么?
KAPA纯珠子在这个工具包提供了反应纯化步骤。顺磁珠的悬挂在一个缓冲区优化净化在下一代测序和其他分子生物学工作流。KAPA纯珠子是兼容手动处理或自动化液体处理,使有效的恢复在两种格式。
包提供strand-specific信息吗?
是的,在第二链合成,cDNA: RNA混合动力转化为dscDNA, dUTP纳入第二cDNA链。在图书馆放大,链包含dUTP不是放大,允许strand-specific测序。这个工具包保留准确链起源信息˃独特的映射读取的99%。
有安全停车点在样品制备过程中?
样品制备过程可以安全地停下来后,前期损耗模块如下:
信使rna被逮捕之后,resuspended珠子(22μL片段,'和洗提缓冲区)可能存储在4°C≤24小时。
核糖体rna和/或球蛋白耗竭后,在1 x片段洗脱之后,首相和洗提缓冲区,样本可能存储在-20°C≤24小时。
从RNA碎片通过图书馆的图书馆建设过程放大可以执行在大约4个小时,根据所处理,样本的数量和经验。如果有必要,安全协议可能停了之后有下列步骤:
什么方法的RNA碎片这工具使用吗?
RNA分散使用高温镁的存在。根据输入的来源和完整性RNA,目的和应用程序,提供了不同的RNA碎片协议获得所需的插入大小分布。等完整的RNA,从新鲜/冷冻组织中提取,不再分裂需要更高的温度。退化的或分散的RNA(如老样品或FFPE组织),使用较低的温度和/或更短的时间。每个产品的技术数据表概述了各种分裂参数取决于输入RNA和所需的插入大小。
KAPA RNA HyperPrep适配器可以使用什么工具?
KAPA Dual-Indexed适配器推荐使用KAPA RNA超准备工具。然而,这些工作流也兼容其他长篇适配器设计在测序和集群生成序列被添加在结扎步骤,如那些通常被用在Illumina公司TruSeq SeqCap EZ,安捷伦SureSelect此时和其他类似的图书馆建设工作流。
自定义适配器的类似的设计和兼容的TA-ligation dsDNA也可能被使用,记住,自定义适配器的设计可能会影响图书馆建设效率。截断适配器的设计,添加集群生成序列在放大而不是结扎,可能需要修改post-ligation清理条件。关于适配器兼容的帮助,请联系我们。
我在哪里找到更多信息KAPA Dual-Indexed适配器吗?
请参阅KAPA Dual-Indexed适配器技术数据表信息条形码序列,池、装备配置、配方和稀释不同KAPA RNA HyperPrep工具和输入。
adapter-ligated cDNA可以保存多久?
净化,adapter-ligated cDNA可以存储在4°C一周或-20°C,至少一个月之前放大和/或测序。为了避免降解,总是储存DNA在缓冲溶液(10毫米Tris-HCl, pH值8.0)和冻融循环的数量最小化。
在KAPA RNA聚合酶用于放大HyperPrep包吗?
KAPA HiFi HotStart DNA聚合酶的酶KAPA HiFi HotStart ReadyMix, KAPA RNA HyperPrep工具包中提供的。这是一个新颖的b族DNA聚合酶工程低偏差,高保真PCR和门店库amplification1试剂的选择,2,3,4。
我应该使用多少个周期当放大我adapter-ligated图书馆吗?
最小化over-amplification和相关的文物,应该优化PCR循环的数量产生足够的决赛,放大库下游分析和质量控制、基于Illumina公司仪器的要求。为目标捕获工作流,通常要求收益率1µg库,可能有所不同取决于所使用的方法和pre-capture采用多路复用策略。
技术数据表中推荐的周期数为每个KAPA RNA HyperPrep工具包应该用来指导图书馆放大,但周期数字图书馆根据期望的最终可能不得不调整产量,图书馆扩增效率、RNA碎片轮廓,和适配器二聚体的存在。
我该如何衡量最后图书馆吗?
dscDNA的大小分布和/或最终放大图书馆应确认的电泳方法。图书馆应该执行的量化与基于qPCR量化工具如KAPA图书馆量化为Illumina公司平台工具。此工具包使用基于Illumina公司流动细胞寡核苷酸引物,并可以用来量化库准备流动池放大。
什么是最好的方法来分析我KAPA RNA HyperPrep数据?
罗氏公司测序解决方案与Genialis提供数据分析和可视化平台,专门为KAPA RNA HyperPrep工具进行验证。这为我们的客户提供了一个端到端的RNA工作流很简单,证明和完整。这种基于云的数据分析解决方案,允许每一个要跟踪处理步骤,以确保质量和再现性和管理数据,项目和合作。
Genialis平台的好处包括:
这个工具包的储存条件是什么?
KAPA RNA HyperPrep工具包中提供多个盒子。
当存储在这些条件下,正确处理,设备组件将保留完整的活动直到截止日期显示在工具标签。
对KAPA适配器执行QC测试是什么?
KAPA适配器进行广泛qPCR——sequencing-based功能和QC测试确认:
图书馆建设效率和adapter-dimer形成低投入的图书馆建设中评估工作流。图书馆建设效率的计算方法是通过测量adapter-ligated图书馆的收益率(放大之前)qPCR(使用KAPA图书馆量化工具),并表示这是一个%的输入DNA。评估adapter-dimer形成,修改后的图书馆建设协议,旨在衡量适配器二聚体具有高敏感性。通过这个试验标准转化为adapter-dimer遗留在标准工作流在0 - 2%的范围。
条形码交叉污染评估排序。每个适配器是一个独特的结扎,合成插入已知的序列使用标准库建设的协议。图书馆是汇集和测序MiSeq™。对于每个条形码,读取(至少115000)的数量与每个96插入数有关,和总%计算正确的插入。污染的条形码在其它任何一个条形码保证< 0.25%。条形码的总水平的污染通常在0.1 - 0.5%的范围。这个试验是无法区分化学交叉污染和适配器“相声”,和措施的总数不正确的插入两种现象造成。适配器“相声”发生在一个条形码是“误读”在测序和随后的分析。“相声”的倾向不同的适配器对和不同取决于条形码序列是密切相关的。
KAPA适配器稀释缓冲是免费检测污染外和核酸内切酶活动,并满足严格的要求对DNA污染。
