KAPA HyperPlus套件提供了一个精简的工作流程，包括完全自动化的碎片和库准备在一个管。该酶裂解试剂盒基于我们的DNA Hyper组合，提供行业领先的文库构建效率。
KAPA HyperPlus套件提供了一个完整的库准备解决方案与KAPA适配器和KAPA HyperPure珠(单独出售)。该试剂盒与Illumina测序平台兼容，并提供合格的自动化方法。
为了实现NGS自动化的即插即用，KAPA HyperPlus工作流也可在我们的自动平台AVENIO Edge系统上使用。
仅供研究使用。不用于诊断程序。
KAPA HyperPlus套件提供了一个精简的工作流程，包括完全自动化的碎片和库准备在一个管。该酶裂解试剂盒基于我们的DNA Hyper组合，提供行业领先的文库构建效率。
KAPA HyperPlus套件提供了一个完整的库准备解决方案与KAPA适配器和KAPA HyperPure珠(单独出售)。该试剂盒与Illumina测序平台兼容，并提供合格的自动化方法。
为了实现NGS自动化的即插即用，KAPA HyperPlus工作流也可在我们的自动平台AVENIO Edge系统上使用。
查看KAPA HyperPlus Kit与NEBNext相比产生的更高结扎后产量的数据®Ultra™II FS试剂盒或covaris剪切DNA与KAPA HyperPrep试剂盒。
图1。KAPA HyperPlus套件在一系列输入量下产量最高。与NEBNext Ultra II FS试剂盒或Covaris剪切结合KAPA HyperPrep相比，KAPA HyperPlus试剂盒(现有和升级的工作流程)将更多的输入DNA转换为适配器连接库。从1 ng, 10 ng和100 ng制备无pcr文库大肠杆菌gDNA使用KAPA UDI适配器和KAPA HyperPure珠子用于所有工作流程，包括NEBNext Ultra II FS套件。结扎后使用KAPA文库定量试剂盒对文库进行定量。
参见来自不同物种样本的DNA文库插入尺寸的可调节性和一致性的性能数据，以及与Nextera Rapid Capture Exome Kit和带有Covaris剪切的KAPA HyperPrep Kit相比，KAPA HyperPlus试剂盒显示最小碎片偏差的比较数据。
图2。KAPA破碎系统可实现可调的酶破碎。将人类基因组DNA (100 ng)在37°C下进行不同时间(5 - 45分钟)的碎片化，以获得大约150 - 800 bp的模式库插入尺寸。KAPA HyperPlus工作流程无需任何尺寸选择，使用全长适配器和4次放大循环。使用LabChip GX Touch HT仪和HT DNA HiSens试剂试剂盒(PerkinElmer)分析最终文库。
图3。定义的片段参数在一系列物种和基因组GC含量中产生一致的文库插入大小。人类基因组DNA (10 ng或50 ng) (41% GC)百日咳博德特氏菌GC (68%),艰难梭状芽胞杆菌GC (29%),大肠杆菌(51% GC)，和恶性疟原虫(20% GC)在37ºC下破碎5、15或45分钟，产生平均库插入大小分别为~700、~350或~200 bp。最终扩增文库的平均片段大小使用Bioanalyzer 2100仪器和高灵敏度DNA检测(安捷伦科技)进行测定。
图4。KAPA HyperPlus工作流的结果是最小的碎片偏差。用KAPA HyperPlus试剂盒、带有Covaris剪切的KAPA HyperPrep试剂盒或Nextera快速捕获外显子组试剂盒(Illumina)从50 ng人类gDNA (41% GC)中制备整个外显子组文库超过40 bp窗口的核苷酸含量(-10到+30 bp相对于读取比对开始)。与机械剪切相比，KAPA HyperPlus试剂盒的酶裂解导致的起始位点偏置略大，但偏置要小得多。配对端测序(2 x 100 bp)在Illumina HiSeq 2500上进行，并使用定制的python脚本进行分析。
图5。KAPA HyperPlus工作流的结果是最小的碎片偏差。用KAPA HyperPlus试剂盒、带有Covaris剪切的KAPA HyperPrep试剂盒或Nextera快速捕获外显子组试剂盒(Illumina)从50 ng人类gDNA (41% GC)中制备整个外显子组文库超过40 bp窗口的核苷酸含量(-10到+30 bp相对于读取比对开始)。与机械剪切相比，KAPA HyperPlus试剂盒的酶裂解导致的起始位点偏置略大，但偏置要小得多。配对端测序(2 x 100 bp)在Illumina HiSeq 2500上进行，并使用定制的python脚本进行分析。
图6。KAPA HyperPlus工作流的结果是最小的碎片偏差。用KAPA HyperPlus试剂盒、带有Covaris剪切的KAPA HyperPrep试剂盒或Nextera快速捕获外显子组试剂盒(Illumina)从50 ng人类gDNA (41% GC)中制备整个外显子组文库超过40 bp窗口的核苷酸含量(-10到+30 bp相对于读取比对开始)。与机械剪切相比，KAPA HyperPlus试剂盒的酶裂解导致的起始位点偏置略大，但偏置要小得多。配对端测序(2 x 100 bp)在Illumina HiSeq 2500上进行，并使用定制的python脚本进行分析。
查看显示相似重复率和敏感性的比较数据，使用升级的KAPA HyperPlus试剂盒与使用Covaris剪切的KAPA HyperPrep试剂盒相比，测序结果有所改善。
图7。低复制率。使用现有的和升级的KAPA HyperPlus Kit使用100 ng输入制备整个人类外显子组库。使用SeqCap EZ MedExome面板进行捕获。
图8。提高测序性能。使用现有的和升级的KAPA HyperPlus Kit使用100 ng输入制备整个人类外显子组库。使用SeqCap EZ MedExome面板进行捕获。链分离人工读(SSARs)表示嵌合读，似乎来自基因组的非连续部分1。1来源:Haile, et al.(2019)从福尔马林固定的石蜡包埋样品中进行下一代基因组DNA测序时错误序列和人工嵌合读取的来源。核酸研究，2019,47,2。doi: 10.1093 / nar / gky1142。
图9。较高的单核苷酸多态性(SNP)敏感性。使用KAPA HyperPrep Kit(现有的和升级的KAPA HyperPlus Kit)使用100 ng高质量gDNA制备整个人类外显子组文库。使用SeqCap EZ MedExome面板进行捕获。
查看性能数据显示，与covaris -shear DNA相比，使用KAPA HyperPlus试剂盒对FFPE样品的覆盖率显著提高。
图10。KAPA HyperPlus试剂盒可提高FFPE样品的覆盖率。使用KAPA HyperPrep试剂盒(含Covaris剪切)或KAPA HyperPlus试剂盒，从200 ng FFPE DNA或50 ng匹配的正常对照(血液DNA)中制备文库。使用定制的SeqCap EZ面板进行了两轮多靶点捕获，针对42个与胃肠道癌相关的基因区域。KAPA HyperPlus库的重复率显著降低，目标率略高，这意味着FFPE样本的覆盖深度显著增加。在covaris剪切DNA与酶切DNA库之间检测到预期频率≥5%的变异，且高度相关(R2 >0.96)。在Illumina MiSeq上进行配对端测序(2 x 150 bp)，并用Picard和Illumina VariantStudio v2.2分析数据。数据由皇家马斯登医院提供。
图11。KAPA HyperPlus试剂盒可提高FFPE样品的覆盖率。使用KAPA HyperPrep试剂盒(含Covaris剪切)或KAPA HyperPlus试剂盒，从200 ng FFPE DNA或50 ng匹配的正常对照(血液DNA)中制备文库。使用定制的SeqCap EZ面板进行了两轮多靶点捕获，针对42个与胃肠道癌相关的基因区域。KAPA HyperPlus库的重复率显著降低，目标率略高，这意味着FFPE样本的覆盖深度显著增加。在covaris剪切DNA与酶切DNA库之间检测到预期频率≥5%的变异，且高度相关(R2 >0.96)。在Illumina MiSeq上进行配对端测序(2 x 150 bp)，并用Picard和Illumina VariantStudio v2.2分析数据。数据由皇家马斯登医院提供。
图12。KAPA HyperPlus试剂盒可提高FFPE样品的覆盖率。使用KAPA HyperPrep试剂盒(含Covaris剪切)或KAPA HyperPlus试剂盒，从200 ng FFPE DNA或50 ng匹配的正常对照(血液DNA)中制备文库。使用定制的SeqCap EZ面板进行了两轮多靶点捕获，针对42个与胃肠道癌相关的基因区域。KAPA HyperPlus库的重复率显著降低，目标率略高，这意味着FFPE样本的覆盖深度显著增加。在covaris剪切DNA与酶切DNA库之间检测到预期频率≥5%的变异，且高度相关(R2 >0.96)。在Illumina MiSeq上进行配对端测序(2 x 150 bp)，并用Picard和Illumina VariantStudio v2.2分析数据。数据由皇家马斯登医院提供。
图13。KAPA HyperPlus试剂盒可提高FFPE样品的覆盖率。使用KAPA HyperPrep试剂盒(含Covaris剪切)或KAPA HyperPlus试剂盒，从200 ng FFPE DNA或50 ng匹配的正常对照(血液DNA)中制备文库。使用定制的SeqCap EZ面板进行了两轮多靶点捕获，针对42个与胃肠道癌相关的基因区域。KAPA HyperPlus库的重复率显著降低，目标率略高，这意味着FFPE样本的覆盖深度显著增加。在covaris剪切DNA与酶切DNA库之间检测到预期频率≥5%的变异，且高度相关(R2 >0.96)。在Illumina MiSeq上进行配对端测序(2 x 150 bp)，并用Picard和Illumina VariantStudio v2.2分析数据。数据由皇家马斯登医院提供。
与NEBNext相比，使用KAPA HyperPlus Kits查看gc偏倚图显示更好的性能Ultra II FS和QIAseq FX工作流程。
图14。GC偏置比较。气相色谱偏置梭状芽孢杆菌，大肠杆菌而且b .百日咳通过使用Picard CollectGCBiasMetrics，计算100 bp和箱中参考样品的GC含量，并绘制KAPA HyperPlus、NEBNext Ultra II FS和QIAseq FX工作流程中这些箱的标准化覆盖率来进行评估。从10 ng输入DNA制备文库。在没有排序偏差的情况下，所有箱子都将具有相等的代表性，以标准化覆盖率为1为中心的水平分布表示。GC含量在基因组中的分布由灰色直方图表示。
图15。GC偏置比较。气相色谱偏置梭状芽孢杆菌，大肠杆菌而且b .百日咳通过使用Picard CollectGCBiasMetrics，计算100 bp和箱中参考样品的GC含量，并绘制KAPA HyperPlus、NEBNext Ultra II FS和QIAseq FX工作流程中这些箱的标准化覆盖率来进行评估。从10 ng输入DNA制备文库。在没有排序偏差的情况下，所有箱子都将具有相等的代表性，以标准化覆盖率为1为中心的水平分布表示。GC含量在基因组中的分布由灰色直方图表示。
图16。GC偏置比较。气相色谱偏置梭状芽孢杆菌，大肠杆菌而且b .百日咳通过使用Picard CollectGCBiasMetrics，计算100 bp和箱中参考样品的GC含量，并绘制KAPA HyperPlus、NEBNext Ultra II FS和QIAseq FX工作流程中这些箱的标准化覆盖率来进行评估。从10 ng输入DNA制备文库。在没有排序偏差的情况下，所有箱子都将具有相等的代表性，以标准化覆盖率为1为中心的水平分布表示。GC含量在基因组中的分布由灰色直方图表示。
*文件中的数据。
| 帽或盘的颜色 | 组件名称 | 包含在KAPA HyperPlus套件中 (07962380001;07962401001;07962428001) |
包含在KAPA HyperPlus套件中 (07962398001;07962410001;07962436001) |
|---|---|---|---|
| 红色的 | KAPA裂解酶 | 是的 | 是的 |
| 蓝色的 | KAPA破碎缓冲液(10X) | 是的 | 是的 |
| 白色 | 空调解决方案 | 是的 | 是的 |
| 橙色 | HyperPlus末端修复和a尾酶 | 是的 | 是的 |
| 紫色的 | HyperPrep末端修复和a -尾酶 | 是的 | 是的 |
| 紫色的 | HyperPrep结束修复和a - tailbuffer | 是的 | 是的 |
| 黄色的 | HyperPrep DNA连接酶 | 是的 | 是的 |
| 黄色的 | HyperPrep连接缓冲区 | 是的 | 是的 |
| 绿色 | KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2X) | 是的 | 没有 |
| 绿色 | KAPA文库扩增引物组合(10X) | 是的 | 没有 |
| 设备代码 | 罗氏的猫。没有 | 描述 | 包大小 |
|---|---|---|---|
| KK8510 | 07962380001 | KAPA HyperPlus工具包 | 8 |
| KK8512 | 07962401001 | KAPA HyperPlus工具包 | 24 |
| KK8514 | 07962428001 | KAPA HyperPlus工具包 | 96 |
| KK8511 | 07962398001 | KAPA HyperPlus Kit(无pcr) | 8 |
| KK8513 | 07962410001 | KAPA HyperPlus Kit(无pcr) | 24 |
| KK8515 | 07962436001 | KAPA HyperPlus Kit(无pcr) | 96 |
所有KAPA适配器套件包含KAPA适配器稀释缓冲液和三个额外的密封膜，以支持多种用途。如果需要，KAPA适配器稀释缓冲液(08278539001)也可单独提供。
| 设备代码 | 罗氏的猫。没有 | 描述 | 包大小 |
|---|---|---|---|
| KK8007 | 08963835001 | KAPA超纯珠子(5 mL) | 5毫升 |
| KK8008 | 08963843001 | KAPA超纯珠子(30 mL) | 30毫升 |
| KK8009 | 08963851001 | KAPA超纯珠子(60 mL) | 60毫升 |
| KK8011 | 08963878001 | KAPA超纯珠(4 × 60 mL) | 4 x 60毫升 |
| KK8010 | 08963860001 | KAPA超纯珠子(450 mL) | 450毫升 |
| KK8727 | 08861919702 | KAPA唯一双索引适配器套件(15 μM) | 96个适配器x 20 μL每个 |
| KK8721 | 08278539001 | KAPA适配器稀释缓冲液(25ml) | 25毫升 |
KAPA HyperPlus工具包的推荐应用是什么?
图书馆建设过程中是否有安全的停歇点?
文库构建过程，从酶裂解到最终文库，根据经验、处理的样品数量以及是否进行文库扩增，可在1.5 - 2.5小时内完成。如有必要，该方案可在结扎后清理完成后或扩增后清理之前安全暂停。
在扩增、目标捕获和/或测序之前，纯化的、适配器连接的文库DNA可在2°C至8°C保存1 -2周，或在-15°C至-25°C保存≤1个月。为了避免降解，尽可能将DNA保存在缓冲溶液(10mm Tris-HCI, pH 8.0 - 8.5)中，并尽量减少冻融循环次数。
我如何选择末端修复和A-Tailinq酶混合物使用?
End Repair和a -tail步骤有两个工作流可用。该方案已被验证用于HyperPrep末端修复和a -尾酶混合物(现有化学成分)或HyperPlus末端修复和a -尾酶混合物(增强化学成分)。HyperPlus末端修复和a -尾尾酶混合物的配方已得到增强，以提高更敏感的测定的性能。KAPA HyperPlus的工作流程没有任何变化，除了在结束修复和a -拖尾步骤中可以使用任何一种末端修复和a -拖尾酶混合物。
对于所有新的应用，建议使用HyperPlus末端修复和a -尾砂酶混合物(增强化学)。对于现有的经过验证的工作流程，建议使用两种酶混合物进行并排比较，并确定哪一种最适合特定的酶
FFPE样品有具体的破碎建议吗?
DNA质量影响FFPE DNA的碎片化。对于Q129/Q41比值为0.4或更高(由KAPA hgDNA定量和QC试剂盒确定)的FFPE样品，技术数据表中提出的指导方针是一个很好的起点。然而，较长的破碎时间可以提高低质量FFPE样品的结果。
较长的片段时间通常会增加输入DNA转化为150 - 250 bp范围内片段的比例，减少残留的高分子量DNA，并与文库构建期间的较高产量相关。
我可以使用什么适配器与这个工具包，在什么浓度?
KAPA适配器推荐与KAPA HyperPlus套件一起使用。然而，该试剂盒也兼容其他全长适配器设计，其中测序和簇生成序列都是在连接步骤中添加的，例如KAPA HyperCap目标富集探针，TruSeq (Illumina)和SureSelect XT2 (Agilent)试剂盒中常规使用的那些，以及其他类似的库构建工作流程。也可以使用具有类似设计并与dsDNA的“TA-ligation”兼容的自定义适配器，请记住，自定义适配器设计可能会影响库构建效率。有关适配器兼容性和订购的帮助，请联系技术支持用于用户提供的文库扩增引物的配制指南。
连接效率在适配器-插入摩尔比从10:1到下表中给出了不同输入的推荐适配器浓度。请注意，较高的适配器-插入摩尔比有利于低输入和具有挑战性的样品。当优化DNA输入25ng的工作流程时，建议评估两到三种适配器浓度。试试表中推荐的浓度，以及2 - 10倍范围内的1 - 2个额外浓度。KAPA适配器可用于适当稀释的所有输入。有关适配器兼容性和订购的帮助，请访问sequencing.roche.com/support。
| 输入DNA | 适配器库存浓度 | 适配器:插入摩尔比 |
| 1μg |
15μM |
10:1 |
| 500 ng | 15μM |
20:1 |
| 250 ng | 15μM |
40:1 |
| 100 ng | 15μM |
100:1 |
| 50 ng | 15μM |
200:1 |
| 25 ng | 7.5μM | 200:1 |
| 10 ng | 3μM |
200:1 |
| 5 ng | 1.5μM |
200:1 |
| 2.5 ng | 750海里 | 200:1 |
| 1 ng | 300海里 | 200:1 |
我在哪里可以找到更多关于KAPA适配器的信息?
有关不同KAPA DNA和RNA文库制备试剂盒和输入的条形码序列、池化、试剂盒配置、配方和稀释的信息，请参阅KAPA适配器技术数据表。
在KAPA适配器上执行什么QC测试?
KAPA适配器经过广泛的qPCR和基于测序的功能和QC测试，以确认:
在低输入库构建工作流中评估库构建效率和适配器二聚体的形成。在分析中达到的转化率表明了文库的建设效率。这是通过qPCR(使用KAPA文库定量试剂盒)测量适配器连接文库(在任何扩增之前)的产量来计算的，并将其表示为输入DNA的%。为了评估适配器-二聚体的形成，使用了一种改进的库构建协议，旨在以高灵敏度测量适配器二聚体。
转接器液化后需要多少次珠基清理?
新颖的单管KAPA HyperPlus化学导致较少的适配器二聚体形成和遗留。在适配器结扎后，一个基于珠的清理足以去除未使用的适配器和适配器二聚体，即使在低输入应用推荐的高适配器-插入摩尔比下也是如此。如果有必要，可以包括第二个连接后(或尺寸选择步骤)清理，以清除所有未使用的适配器和适配器二聚体的痕迹，特别是对于无pcr的工作流。
应该使用多少循环的文库扩增?
如果循环完成(不推荐)，单个50 μL KAPA HiFi文库扩增反应可产生8 - 10 μg扩增文库。为了最大限度地减少过度扩增和相关的不需要的人工产物，扩增周期的数量应量身定制，以产生下游工艺所需的最佳扩增库数量。这通常在250 ng - 1.5 μg的最终扩增文库范围内。
在库放大之前对连接的库进行量化可以极大地促进库放大参数的优化，特别是在库构建工作流程首次建立或优化时。可用于文库扩增的模板DNA(适配器连接的分子)的数量可以使用KAPA文库定量试剂盒从适配器连接的文库DNA中获得大约1 μg扩增文库DNA所需的理论循环数来确定，如最新版本的KAPA HyperPlus技术数据表所示。
图书馆是否需要放大?
根据您的应用程序所需的库资料的数量，可以省略库放大。在这种情况下，重要的是要确保适配器的设计能够支持样本索引(在需要时)、聚类放大和测序。省去了库放大，进一步简化了工作流程，并将整个库准备时间减少到≤1.5小时。KAPA HyperPlus试剂盒可实现高转换效率，从低至50 ng的输入DNA实现无pcr工作流程。KAPA HyperPlus试剂盒不含扩增试剂(07962398001,07962410001和07962436001)，可用于无pcr工作流程。
我如何评估我的图书馆在准备后的质量?
文库大小分布，引物二聚体和/或过度扩增产物的缺乏，应通过电泳方法确认。建议使用KAPA文库定量试剂盒进行基于qpcr的文库定量，然后再进行目标捕获或测序。基于qpcr的适配器连接库定量(在库放大之前)可以为协议优化和故障排除提供有用的数据。
KAPA HvperPlus试剂盒的保质期和推荐存储条件是什么?
本试剂盒中提供的酶对温度敏感，在运输和储存过程中应采取适当的小心。KAPA HyperPlus试剂盒根据目的地国家的不同，采用干冰或冰袋运输。收到后，立即将酶和反应缓冲液保存在-15°C至-25°C的恒温冰箱中。当在这些条件下储存并正确处理时，试剂盒组件将保持完全活性，直到试剂盒标签上显示的有效期。