罗氏测序解决方案提供KAPA HiFi尿嘧啶+试剂盒，包含工程KAPA HiFi HotStart尿嘧啶+ DNA聚合酶，以Readymix格式配方。这些试剂盒是KAPA HiFi试剂盒家族的一部分，提供同样的好处，但进化用于扩增尿嘧啶和修饰残基。
下表描述了KAPA HiFi HotStart Uracil+ ReadyMix套件的规格:
仅供研究用途。不用于诊断程序。
KAPA HiFi尿嘧啶+试剂盒是KAPA HiFi尿嘧啶+ DNA聚合酶家族的一部分，其中KAPA HiFi HotStart尿嘧啶+ DNA聚合酶是KAPA HiFi HotStart DNA聚合酶的改良版本，被设计成可以耐受亚硫酸氢盐处理DNA中的尿嘧啶残留。亚硫酸氢盐处理DNA导致未甲基化胞嘧啶残基转化为尿嘧啶，而甲基化残基未被修饰。亚硫酸盐测序工作流程中用于文库扩增的酶必须能够读取尿嘧啶残基并耐受低浓度的AT-rich DNA。传统的高保真DNA聚合酶通常不适合这种类型的应用，因为当遇到尿嘧啶时酶会停止。
KAPA HiFi HotStart尿嘧啶+ DNA聚合酶被开发用于读取尿嘧啶残基和其他修饰的碱基，同时仍然保留了KAPA HiFi HotStart DNA聚合酶的性能优势，包括超高保真度、高效率和低偏置扩增。这降低了重复率，提高了具有挑战性区域的覆盖率。
查看KAPA HiFi尿嘧啶数据，显示dUTP没有抑制作用。
图1。dUTP不抑制KAPA HiFi Uracil+。采用SYBR Green实时荧光定量PCR技术，在10倍稀释(80 pM - 0.8 fM)条件下，使用或不使用0.2 mM dUTP检测452 bp扩增子的扩增。KAPA HiFi DNA聚合酶表现出典型的尿嘧啶抑制作用，而KAPA HiFi尿嘧啶+ DNA聚合酶则无扩增抑制作用。
图2。dUTP不抑制KAPA HiFi Uracil+。采用SYBR Green实时荧光定量PCR技术，在10倍稀释(80 pM - 0.8 fM)条件下，使用或不使用0.2 mM dUTP检测452 bp扩增子的扩增。KAPA HiFi DNA聚合酶表现出典型的尿嘧啶抑制作用，而KAPA HiFi尿嘧啶+ DNA聚合酶则无扩增抑制作用。
查看比较数据显示，与安捷伦Pfu Turbo Cx相比，使用KAPA HiFi Uracil+的产量更高，尺寸偏差更小。
图3。KAPA HiFi Uracil+提供更高的产量和最小的尺寸偏差。采用12、14或16个周期的标准方案对亚硫酸盐处理的人类全基因组文库进行扩增，并使用Bioanalyzer 2100高灵敏度DNA芯片对扩增的文库进行分析。与安捷伦Pfu Turbo Cx相比，KAPA HiFi尿嘧啶+ DNA聚合酶产量更高(左)，尺寸偏差很小(右)
图4。KAPA HiFi Uracil+提供更高的产量和最小的尺寸偏差。采用12、14或16个周期的标准方案对亚硫酸盐处理的人类全基因组文库进行扩增，并使用Bioanalyzer 2100高灵敏度DNA芯片对扩增的文库进行分析。与安捷伦Pfu Turbo Cx相比，KAPA HiFi尿嘧啶+ DNA聚合酶产量更高(左)，尺寸偏差很小(右)
见全基因组亚硫酸氢盐(WGBS)文库显示更高和更均匀覆盖率的数据。
图5。与安捷伦Pfu Turbo Cx试剂盒相比，KAPA HiFi HotStart Uracil+ DNA聚合酶具有更高和更均匀的覆盖率，从而改善了AT-rich序列的表达。使用KAPA HiFi HotStart Uracil+ ReadyMix Kit或Agilent Pfu Turbo Cx扩增100 ng亚硫酸钠处理的文库DNA(8个周期)。
图6。与安捷伦Pfu Turbo Cx试剂盒相比，KAPA HiFi HotStart Uracil+ DNA聚合酶具有更高和更均匀的覆盖率，从而改善了AT-rich序列的表达。使用KAPA HiFi HotStart Uracil+ ReadyMix Kit或Agilent Pfu Turbo Cx扩增100 ng亚硫酸钠处理的文库DNA(8个周期)。
查看数据显示，在使用SeqCap进行目标富集后，由KAPA HiFi尿嘧啶有效扩增亚硫酸盐处理的DNA®Epi目标浓缩试剂盒。
图7。利用SeqCap Epi靶富集系统识别差异甲基化区域。文库来自Burkitt淋巴瘤细胞系(NA04671)或正常对照细胞系(CEPH;NA12762) DNA用KAPA HTP文库制备试剂盒进行扩增，预捕获扩增后进行亚硫酸盐处理。捕获采用3.2 Mb SeqCap Epi Choice设计，并用KAPA HiFi Uracil+扩增。差异甲基化观察到的甲基化百分比在淋巴瘤细胞系DNA与正常细胞系DNA中大幅增加。
*数据文件。
罗氏测序解决方案提供KAPA HiFi尿嘧啶+试剂盒，包含工程KAPA HiFi HotStart尿嘧啶+ DNA聚合酶，以Readymix格式配方。这些试剂盒是KAPA HiFi试剂盒家族的一部分，提供同样的好处，但进化用于扩增尿嘧啶和修饰残基。
下表描述了KAPA HiFi HotStart Uracil+ ReadyMix套件的规格:
| KAPA HiFi HotStart Uracil+ ReadyMix Kit | |
|---|---|
| HotStart酶 | 是的 |
| 格式 | ReadyMix |
| 包内容 | KAPA HiFi HotStart Uracil+ ReadyMix |
| 推荐应用 | PCR和NGS应用需要扩增尿嘧啶或修饰残基，如亚硫酸盐转换文库扩增 |
KAPA HiFi HotStart Uracil+ ReadyMix套件的推荐应用是什么?
KAPA HiFi HotStart尿嘧啶+ DNA聚合酶和KAPA HiFi HotStart DNA聚合酶有什么区别?
KAPA HiFi HotStart DNA聚合酶的尿嘧啶结合袋被灭活，使含尿嘧啶DNA扩增，从而产生KAPA HiFi HotStart尿嘧啶+ DNA聚合酶。KAPA HiFi HotStart尿嘧啶+ DNA聚合酶表现出与未修饰酶相同的高效率、低偏置扩增和覆盖均匀性。
当使用KAPA HiFi HotStart Uracil+ ReadyMix Kit时，优化的关键领域是什么?
反应设置:
循环参数:
KAPA HiFi HotStart尿嘧啶+ DNA聚合酶的推荐延伸率是多少?
对于≤1 kb的目标，推荐的扩展速率为15秒，对于较长的目标，推荐的扩展速率为30 - 60秒/kb，或为了提高产量。
KAPA HiFi HotStart尿嘧啶+ DNA聚合酶的最佳退火温度是多少?
特定引物对的最佳退火温度可能高于传统PCR缓冲液中使用的温度。建议初始退火温度为60℃。也可以采用两步循环协议，组合退火/延伸温度范围为68 - 75℃，组合退火/延伸时间为30秒/kb。
当使用KAPA HiFi HotStart Uracil+ ReadyMix Kit时，是否需要在PCR反应中添加镁?
KAPA HiFi HotStart Uracil+ ReadyMix含有浓度为2.5 mM的Mg2+，这是大多数应用的最佳选择。反应可补充任何聚合酶链反应级MgCl2溶液。添加0.5µL的25 mM MgCl2溶液，使50µL反应的最终浓度增加0.25 mM。可能有必要测试一个浓度范围，以确定您的特定PCR或NGS应用的最佳条件。
HotStart的制定意味着什么?
专有抗体使聚合酶失活，直到第一个热变性循环。这最大限度地减少了在反应建立和启动过程中可能由非特异性启动事件产生的假扩增产物，并提高了整体反应效率。
KAPA HiFi HotStart Uracil+ ReadyMix套件的储存建议是什么?
收到后，将整个套件保存在-20°C的恒温冰箱中。试剂盒可储存在4°C下定期短期使用(最多一个月)。只要小心处理，没有被污染，即使在室温下放置短时间(最多三天)，产品也不会受到损害。不建议在室温或4℃下长期保存。请注意，保存在-20°C以上的试剂在被用户污染时更容易降解;因此，在这种温度下储存的风险由用户自己承担。
为什么KAPA HiFi HotStart Uracil+ ReadyMix套件非常适合NGS应用?
KAPA HiFi HotStart Uracil+ ReadyMix套件特别适合NGS应用，提供高效、低偏差的亚硫酸盐转换库扩增。KAPA HiFi HotStart尿嘧啶+ DNA聚合酶文库扩增可改善覆盖深度的均匀性，并在参考序列间具有更多的代表性。
为什么KAPA HiFi HotStart Uracil+ ReadyMix非常适合损伤DNA样本的扩增?
胞嘧啶脱胺在很长一段时间内自发发生，并且在温度升高时更快，并导致尿嘧啶在DNA和游离核苷酸之间的积累。当其他校对酶失效时，KAPA HiFi HotStart尿嘧啶+ DNA聚合酶允许从含有尿嘧啶的受损DNA模板中进行高保真扩增。
为什么KAPA HiFi HotStart Uracil+ ReadyMix非常适合用于预防携带扩增子污染?
KAPA HiFi HotStart尿嘧啶+ DNA聚合酶在扩增过程中很容易结合dUTP，因此可以与尿嘧啶-DNA-糖基化酶(UDG)联合使用，以防止携带污染。dUTP被添加到PCR反应中，以便在扩增之前用UDG消化去除可能污染后续反应的扩增子。
亚硫酸盐转化的NGS文库扩增的最佳循环数是多少?
对于特定的样品和协议，优化周期数是很重要的;对亚硫酸盐转化的NGS文库进行充分扩增通常需要8-14个PCR循环。与所有NGS应用一样，最佳文库扩增应为样品验证(QC)和测序提供足够的材料，同时避免过度扩增，这可能导致不良的伪影，如PCR重复、扩增偏置、文库复杂性降低和PCR错误。