KAPA2G鲁棒PCR试剂盒

KAPA2G鲁棒PCR试剂盒的推荐应用是什么?

• 放大高GC或AT内容的模板
• 在抑制野生型的水平上扩增含有常见PCR抑制剂的模板Taq
• 从粗样本(如口拭子)中进行扩增;培养的哺乳动物，细菌或酵母细胞(集落PCR)，小鼠尾巴和耳朵粗裂解物
• 当模板质量或引物设计存在问题时，提高测定的收率和/或灵敏度
  

为什么KAPA2G稳健性PCR试剂盒是稳健性PCR的首选产品?

KAPA2G鲁棒PCR试剂盒是独特的，因为它们包含KAPA2G鲁棒DNA聚合酶，一种通过定向进化过程设计的第二代酶。KAPA2G健壮DNA聚合酶中的新氨基酸突变提供了更高的连续性和比活性，这转化为在广泛的富含AT和gc的扩增子上的健壮性能。此外，与野生型相比，KAPA2G鲁棒DNA聚合酶对常见PCR抑制剂(如盐、尿素、SDS和乙醇)的耐受性有所提高Taq或者所谓的耐热聚合酶的“健壮”混合物。

优化的关键领域是什么?

• 反应装置
  • 起始模板量:对于高质量的DNA，大多数应用使用1 - 50ng基因组DNA或≤1ng质粒/lambda DNA每25µL反应。对于粗样品、被抑制剂污染的DNA和低质量DNA，在模板稀释系列PCR中确定每次反应的最佳模板浓度。
  • 模板质量:在降解的DNA、低浓度的DNA和/或含有高水平PCR抑制剂的DNA中，不应期望目标扩增子的高产量。
  • 酶量:每25 μ L反应使用0.5 U KAPA2G Robust获得高质量DNA。每25 μ L反应使用1u酶处理富gc扩增子和其他难处理样品。
  • 引物和dNTP浓度:每个dNTP的最终浓度为0.2 mM，每个引物的最终浓度为0.5 M。
  • 基因组目标长度:使用KAPA2G Robust成功扩增了超过6kb的片段。然而，长片段的成功与否在很大程度上取决于模板质量、引物和模板特性。对于长DNA片段的稳健扩增，使用KAPA HiFi DNA聚合酶
• 循环参数
  • 延长时间:每个周期使用15-30秒/kb。延长时间过长可能导致非特异性扩增或涂抹，而过短则可能导致低收率。
  • 退火时间:使用15秒每个周期为高质量的DNA。对于慢速循环器或减少反应体积(<25 L)，这可能减少到每循环10秒。对于困难的样品，退火时间可以增加到每循环30秒
  • 退火温度:最佳退火温度不仅取决于底漆和模板的特性，还取决于化学环境(缓冲液、添加剂和样品成分)。从已知的退火温度开始，或使用55°C作为第一个方法。进行退火温度梯度PCR，以确定产生最高产量的特定产物的退火温度。
    

如果用KAPA2G Robust生成的PCR产物含有高背景的非特异性扩增子或高分子量涂片，那么优化的关键领域是什么?

• 将退火时间缩短到每循环10-15秒。
• 在退火温度梯度PCR中增加退火温度或确定最佳退火温度。退火温度通常不建议小于55°C。
• 对于≤1kb的放大器，将扩展时间缩短到15秒/kb /周期，对于1kb - 3.5 kb的放大器，缩短到15 - 30秒/kb /周期。
• 减少反应中模板的数量。对于高质量的DNA，大多数应用使用1 - 50ng基因组DNA或≤1ng质粒/lambda DNA每25 μ L反应。
• 减少循环次数。
• 减少每次反应的酶量。
• 尝试不同的KAPA2G健壮缓冲提供的套件。
• 在与KAPA2G缓冲A或B配制的反应混合物中加入1倍KAPA增强剂1。
• 优化MgCl2浓度。
• 在反应中加入DMSO，最终浓度为5%-10%。
• 降低引物浓度，但不低于每个引物的0.1µM。不要将低浓度的底漆与低于通常浓度(每个0.2 mM)的dNTP混合使用。
• 重新设计引物以消除引物间或引物内的相互作用或提高特异性。
  

KAPA2G健壮DNA聚合酶的推荐延长时间是多少?

每个周期15秒/kb的延长时间适用于大多数PCR检测，当使用高浓度的高质量模板时，甚至可以减少到5-10秒/kb /周期。然而，对于粗样品、富气相色谱扩增子或模板或其他困难的分析，延长时间可能增加到30秒/kb /周期。如果发生涂抹或获得非特异性扩增子的高背景，则将扩展时间缩短到每周期15秒/kb。

什么时候我应该优化每次反应的KAPA2G健壮DNA聚合酶的数量?

0.5单位KAPA2G健壮DNA聚合酶每25 μ L反应(或比例或更多或更小的反应体积)足够大多数标准PCR应用。

• 在以下情况下增加每次反应的酶量:
  • 对于富gc扩增子(每25 μ L反应使用1个单位)。
  • 对于粗模板或含有抑制剂的模板(每25 μ L反应使用1-2个单位)。
  • 对于长片段，但仅当模板拷贝数较高时(每25µL反应使用1个单位或等效)。
• 在以下情况下减少每次反应的酶量:
  • 当发生涂抹时，特别是在长片段的放大过程中。
  • 当模板浓度较低时。
  • 当获得非特异性放大子的高背景时。
    

用KAPA2G Robust PCR试剂盒进行PCR反应时是否需要添加镁?

所有三种KAPA2G缓冲液都是5X缓冲液，其中包括1.5 mM浓度为1倍的MgCl2。所有试剂盒中都提供额外的MgCl2 (25 mM)，用于需要额外的MgCl2或优化最终MgCl2浓度的测定。

我如何优化PCR检测，以常规使用含有抑制剂的DNA或粗样品作为模板?

• 如果可能，以一种允许制备高质量模板DNA的形式获得目标扩增子，例如将目标片段克隆到质粒中。如果这是不可能的，通过将引物序列克隆到质粒中来创建一个人工靶标，这种方法的扩增将产生与真实靶标中相似的扩增子大小和GC含量。
• 从这个来源中纯化模板DNA，使用它来设置和优化基本的检测参数(试剂浓度和循环参数)，并确定检测的灵敏度(检测到的目标副本的最小数量)。
• 准备10倍稀释的实验模板系列。建立重复反应，其中一组用已知数量的目标扩增子加标(如上所述，来自人工源)。在检测优化过程中，人工控制目标的拷贝数应比用优质DNA获得的最小可检测拷贝数多10 - 100倍。
• 这种稀释系列实验的结果将表明实验模板中的抑制元素是否可以被稀释掉，同时保持在目标放大子的灵敏度范围内。如果没有合适的人工对照模板，则可以在反应中添加不同的对照扩增子模板和第二引物集，前提是该对照物在相同的反应条件下被有效扩增。
• 如果广泛的优化仍然产生非常低的浓度的目标扩增子，使用该PCR的产物在第二轮扩增。第二轮可以使用相同或嵌套的引物对。进行一系列反应，包括1µL未稀释、10倍稀释、100倍稀释或1000倍稀释的第一轮产品。根据应用的不同，将第二次PCR限制在10-30个循环。
  

KAPA2G健壮的HotStart和KAPA2G健壮的HotStart有什么区别?

KAPA2G Robust HotStart是KAPA2G Robust DNA聚合酶的抗体介导热启动配方。对于需要室温设置的工作流，必须使用HotStart配方。非热启动和热启动配方在大多数试验中应该有相似的结果。

KAPA2G鲁棒PCR试剂盒的储存建议是什么?

长期储存KAPA2G健壮酶、KAPA2G缓冲器A、B和GC缓冲器、KAPA增强剂1、dNTPs和MgCl2的建议温度为-20℃。但是，这些试剂盒组分或由其制备的PCR主混合物可在4℃下存储短期使用(最多一个月)。

我在PCR反应中应该使用哪种KAPA2G Buffer ?

健壮酶具有三种不同的反应缓冲液和专有添加剂KAPA增强剂1。这为优化提供了五种缓冲/加性组合:

• KAPA2G缓冲一个
• KAPA2G缓冲器A + KAPA增强器
• KAPA2G缓冲B
• KAPA2G缓冲器B + KAPA增强器
• KAPA2G GC Buffer(不与KAPA增强器1结合使用)

对于特定的引物-模板组合或模板类型，不可能预测哪种缓冲剂/添加剂组合将产生最好的结果。但是，以下的准则可以作为起点:

• 对高质量的DNA或GC含量<65%的扩增子使用KAPA2G Buffer A(含或不含KAPA增强子1)。
• 使用KAPA2G缓冲器B(含或不含KAPA增强子1)用于低质量DNA、含有阴离子抑制剂的DNA、粗样品或较长的扩增子。
• 对于GC含量为>65%的放大器使用KAPA2G GC Buffer

对于抗扩增的富gc扩增子，可以尝试以下附加缓冲/添加剂组合:

• KAPA2G GC Buffer + 4% DMSO
• KAPA2G缓冲A + KAPA增强剂1 + 5% DMSO
• 对于新的分析，建议在进一步优化之前，并行评估所有五种基本缓冲/添加剂组合，以确定哪一种组合能产生特定产品的最高收率。
  

我什么时候应该在PCR反应中使用KAPA增强子1 ?

KAPA Enhancer 1是一种专有的PCR添加剂(DNA不稳定剂)，可以提高一些引物-模板组合的反应效率和特异性，但不是所有的引物-模板组合。对于有问题的分析，首先尝试KAPA2G Buffer A或B，使用或不使用1X KAPA Enhancer 1，然后尝试进一步优化。不要将GC缓冲区和KAPA增强器1结合使用。

如果我现有的检测需要一个专门的缓冲，我还可以使用KAPA2G Robust吗?

KAPA2G鲁棒性和KAPA2G鲁棒性HotStart PCR试剂盒中提供的缓冲液是专门为新型KAPA2G鲁棒性DNA聚合酶开发的，强烈建议将试剂盒中提供的缓冲液/添加剂组合作为首选方法进行评估。健壮酶应该与任何用于野生型或热启动的PCR缓冲剂兼容Taq，只要pH值为8.3或更高。当使用自定义缓冲液时，可能需要优化反应参数(如酶、模板和MgCl2浓度和退火温度)。

KAPA2G鲁棒PCR试剂盒是否与PCR添加剂兼容?

KAPA2G健壮的缓冲液已被配制成在多种反应条件下，具有不同的模板和扩增子类型的最佳酶性能，大多数应用不需要额外的添加剂。如果一个标准反应(不添加任何添加剂)不能产生令人满意的结果，总是首先尝试1X KAPA增强剂1(与KAPA2G缓冲a或B结合使用)或KAPA2G GC缓冲液来改善结果。如果仍然不奏效，可以尝试以下策略:

• 在与KAPA2G缓冲a或b进行的反应中加入最终浓度为1-10%的DMSO，与KAPA2G GC缓冲进行的反应中可添加至多4%的DMSO。
• 包括通常用于野生型的其他PCR添加剂Taq(如牛血清白蛋白、甘油、单链结合蛋白、聚乙二醇、甘氨酸)。与野生型相比，健壮型KAPA2G通常能耐受更高浓度的添加剂Taq，但每种添加剂的相对优势和最佳浓度将必须通过经验来确定。
• KAPA增强剂1具有类似甜菜碱的性质。它可以在1倍浓度的情况下代替甜菜碱使用，在任何试验中都可以从加入甜菜碱中获益。不要将KAPA增强剂1和甜菜碱混合使用。
• 反应中加入5%的甘油或0.1%的吐温20通常能提高长片段的扩增。但是，对于>3 kb的扩增子，推荐使用KAPA HiFi。
  

用KAPA2G Robust产生的PCR产物能否被消化、克隆和测序?

KAPA2G健壮型PCR产物与野生型PCR产物具有相同的特性Taq或热启动配方，并适用于常规下游应用，如用限制性内切酶消化和测序。用KAPA2G Robust产生的PCR产物是3 ' - da尾的，可以用于TA克隆，也可以在克隆之前钝端或用限制性内切酶消化。为了获得最好的结果，建议使用任何标准的PCR净化试剂盒来纯化PCR产物。

用KAPA2G鲁棒PCR试剂盒产生的PCR产物可以用dHPLC分析吗?

是的。用KAPA2G Robust或KAPA2G Robust HotStart生成的PCR产品，使用KAPA2G缓冲器A(含或不含KAPA增强剂1)、KAPA2G缓冲器B(含或不含KAPA增强剂1)或KAPA2G GC缓冲器在推荐的最终浓度下不含矿物油、甲酰胺、蛋白酶K、BSA、高分子量稳定剂(如PEG)、洗涤剂(如SDS、Triton X-100、吐温20、Nonidet-P40)、甘油、甜菜碱或DMSO的最终浓度超过Transgenomic WAVE dHPLC系统直接分析的最大允许浓度。

我可否使用KAPA2G鲁棒PCR试剂盒进行多重PCR?

KAPA2G Fast HotStart是多重PCR(当有高质量的模板DNA时)的推荐产品，即使减少反应时间不是优先考虑的。有关更多信息，请参阅应用说明:多重PCR。从粗样本中进行PCR具有挑战性，因为粗样本PCR的扩增效率通常低于用高质量的纯化DNA作为模板获得的扩增效率。KAPA2G Robust HotStart可用于低复杂度的多重PCR检测(2 - 3引物，扩增子<2 kb)，这些检测来自难以扩增的，粗提取的或质量较差的模板DNA，如果是野生型的Taq收益率差的结果。很可能需要对反应进行优化。

如何使用KAPA2G鲁棒PCR试剂盒制备粗样PCR模板?

粗样PCR是一项具有挑战性的应用，很难预测哪些扩增子可以从哪种粗样类型中成功扩增。下面给出的方案是使用KAPA2G鲁棒PCR试剂盒制备粗模板和粗样品PCR的起点。

• 将少量待测样品(如2毫米的叶片冲孔，2毫米的组织切片，2µL的液体样品)置于50µL的10 mm Tris-HCl中，pH为8-8.5，旋涡旋转15秒。
• 在95°C孵育10分钟。孵化后，旋涡15秒。
• 在台式离心机中以最大速度离心1分钟，以收集管底部的碎片。
• 将上清液转移到新的微离心管中，准备5倍的连续稀释液(10 mM Tris-HCl, pH 8-8.5)。准备至少5种稀释剂。
• 使用KAPA2G Robust或KAPA2G Robust HotStart进行PCR反应时，使用每种稀释剂的2.5µL，使用用户指南中的反应设置条件。
• 从以下循环轮廓开始:初始变性:在95°C下3分钟，变性:15秒(95°C)每循环;退火:15秒(55 - 65°C) /周期，扩展(72°C): 30秒/kb /周期。循环次数:35-40。
• 同时评估KAPA2G Buffer A和KAPA2G Buffer B(含或不含KAPA增强剂1)，以确定哪种缓冲/添加剂组合最适合特定的样品类型。大多数情况下，粗样PCR首选缓冲液B。
• 对于GC含量高(60-70%)的扩增子，评估KAPA2G GC Buffer或KAPA2G Buffer B + 5% DMSO。
• 粗样PCR不适用于>1 kb扩增子或难以用野生型扩增的扩增子Taq当使用高质量DNA作为模板时。
• 请参阅申请须知老鼠的基因了解如何使用KAPA2G Robust以小鼠耳或尾部裂解物为模板进行小鼠基因分型的具体细节。
  

富gc PCR的最佳策略是什么?

• 每25 μ L反应使用1单位酶或等效物。
• 第一种方法是使用1X KAPA2G GC Buffer，不添加任何添加剂。
• 对于抗性特别强的模板/放大器，可以尝试1X KAPA2G GC Buffer + 4% DMSO或1X KAPA2G Buffer A + 1X KAPA Enhancer 1 + 5% DMSO。
• 确保模板被正确地变性。使用初始变性时间5-10分钟在95°C或预变性模板。每循环95°C变性15-30秒。
• 请参阅申请须知常规GC-Rich PCR为更多的信息。
  

大肠杆菌菌落PCR的最佳策略是什么?

• 每25µL反应使用0.5-1.0 U酶或等效物。
• 使用KAPA2G Buffer B或KAPA2G GC Buffer用于富GC扩增。KAPA增强子1在某些情况下可以改善结果。
• 引物的最终浓度为0.5 μM, dNTPs的最终浓度为0.2 mM。最终1.5 mM的MgCl2浓度(在所有KAPA2G缓冲液中以1倍浓度存在)应该足以满足大多数菌落pcr。如果产率或特异性较低，或已知特异性扩增子需要更高的最佳MgCl2浓度，可以将其补充到2-5 mM MgCl2的最终浓度。这包括AT富模板。
• 包括1-2 μ L的an大肠杆菌菌落重悬于10-20µL PCR水中，或每25µL反应孵育1µL。
• 初始变性时间为5分钟(95°C)，变性时间为10-15秒(95°C)。
• 每循环退火时间为10-15秒。
• 对于≤500bp的放大器，使用每周期5秒的扩展时间(72°C)，或对于> 500bp的放大器，每周期15 - 30秒/kb。
• 从30个循环开始。根据产量的不同，可以减少到25个周期，也可以增加到35个周期。
• 请参阅申请须知菌落PCR为更多的信息。
  

酵母菌落PCR的最佳策略是什么?

• 每25µL反应使用1.0 U酶或等效物。
• 使用KAPA2G Buffer B或KAPA2G GC Buffer用于富GC扩增。KAPA增强子1在某些情况下可以改善结果。
• 引物的最终浓度为0.5 μM, dNTPs的最终浓度为0.2 mM。最终1.5 mM的MgCl2浓度(在所有KAPA2G缓冲液中以1倍浓度存在)应该足以满足大多数菌落pcr。如果产率或特异性较低，或已知特异性扩增子需要更高的最佳MgCl2浓度，可以将其补充到2-5 mM MgCl2的最终浓度。这包括AT富模板。
• 用0.1 M NaOH或Zymolase在37°C裂解酵母细胞(过夜菌落或培养)至少5分钟。
• 每25µL反应包含2.5µL的裂解酵母细胞悬液。
• 每个周期的初始变性时间为5分钟(95°C)和30秒变性时间(95°C)。
• 每循环退火时间为10-15秒。
• 对于≤500bp的放大器使用扩展时间(72°C)每周期15秒，或> 500bp的放大器每周期30秒/kb。
• 从30个循环开始。根据产量的不同，可以减少到25个周期，也可以增加到35个周期。

请参阅申请须知菌落PCR为更多的信息。